組氨(an)酸(suan)標(biao)簽蛋白分(fen)離(li)層(ceng)析親(qin)和純化介質(zhi) Ni NTA Beads 是(shi)以4%瓊脂(zhi)糖凝膠(jiao)為基質(zhi)，通(tong)過化學方(fang)法偶聯了(le)四配(pei)位的氮(dan)川三(san)乙(yi)酸（ NTA），螯(ao)合鎳(nie)離(li)子(zi)（ Ni2+）後(hou)，可以(yi)形(xing)成非(fei)常(chang)穩(wen)定(ding)的八面體結構，鎳(nie)離(li)子(zi)處於(yu)八面體的中心(xin)，這(zhe)樣(yang)的結(jie)構很(hen)有效(xiao)的(de)保護(hu)了(le)鎳(nie)離(li)子(zi)免受(shou)小(xiao)分子(zi)的進攻(gong)，更加穩(wen)定(ding)。 Ni NTA Beads可以(yi)耐受(shou)壹定(ding)濃度的(de)還原劑(ji)、變(bian)性(xing)劑(ji).

組氨(an)酸(suan)標(biao)簽蛋白分(fen)離(li)層(ceng)析親(qin)和純化介質(zhi) Ni NTA Beads 產(chan)品信息

Ni NTA Beads是(shi)以(yi)4%瓊(qiong)脂(zhi)糖凝膠(jiao)為基質(zhi)，通(tong)過化學方(fang)法偶聯了(le)四配(pei)位的氮(dan)川三(san)乙(yi)酸（ NTA），螯(ao)合鎳(nie)離(li)子(zi)（ Ni2+）後，可以(yi)形(xing)成非(fei)常(chang)穩(wen)定(ding)的八面體結構，鎳(nie)離(li)子(zi)處於(yu)八面體的中心(xin)，這(zhe)樣(yang)的結(jie)構很(hen)有效(xiao)的(de)保護(hu)了(le)鎳(nie)離(li)子(zi)免受(shou)小(xiao)分子(zi)的進攻(gong)，更加穩(wen)定(ding)。 Ni NTA Beads可以(yi)耐受(shou)壹定(ding)濃度的(de)還原劑(ji)、變(bian)性(xing)劑(ji).

組氨(an)酸(suan)標(biao)簽蛋白分(fen)離(li)層(ceng)析親(qin)和純化介質(zhi) Ni NTA Beads    產(chan)品性能(neng)

2.純化流程

2.1緩沖(chong)液的(de)準(zhun)備(bei)

可使(shi)用(yong)下列(lie)拋李(li)緩沖(chong)液，也(ye)可根(gen)據自己的(de)使用(yong)習慣(guan)配(pei)置不(bu)同的緩(huan)沖(chong)液體(ti)系(xi)，基本(ben)原理(li)就(jiu)是低(di)咪(mi)唑(zuo)上(shang)樣(yang)，高咪(mi)唑(zuo)洗(xi)脫(tuo)，或者(zhe)高 pH上樣(yang)，低(di)pH洗(xi)脫(tuo)。緩沖(chong)液在(zai)使(shi)用(yong)前最(zui)好用(yong)0.22 pm 載者(zhe)0.45 μm 濾膜過濾(lv)。因為(wei)NINTA Beads可以(yi)用(yong)於(yu)可溶蛋白和包涵體蛋白的(de)純化，兩種方(fang)法所需(xu)緩沖(chong)液不(bu)同。具體(ti)配(pei)置方(fang)法見(jian)表(biao)3、表(biao)4和表(biao)5。

2.2樣(yang)品準備(bei)

2.2.1細(xi)菌或酵母表(biao)達的蛋白

1）挑(tiao)取(qu)單(dan)茵落到培養(yang)基中(zhong)，根(gen)據(ju)載體(ti)使(shi)用(yong)說明(ming)，加入(ru)相(xiang)應(ying)濃度的(de)誘導(dao)劑(ji)誘(you)導(dao)相應(ying)的(de)時(shi)間(jian)。

2）表(biao)達結束後(hou)，將培養(yang)液轉(zhuan)移到離(li)心(xin)杯(bei)中(zhong)，7，000 pm（7，500xg），離(li)心(xin) 15 min收(shou)集菌體，然(ran)後(hou)按(an)照菌(jun)體(ti)；Lysis Buffer=1∶10（W//）加(jia)

入(ru)Lysls Buffer，加入(ru)終濃度為(wei)1 mM的PMSF。加(jia)入(ru)溶菌酶(mei)（工(gong)作(zuo)濃度為(wei)0.2-0.4 mg/ml，如果(guo)表(biao)達的宿主(zhu)細(xi)胞內(nei)含(han) pLysS 或 pLysE，可以(yi)不(bu)加溶菌酶(mei)），（同(tong)時(shi)也(ye)可加(jia)入其(qi)他(ta)蛋白酶(mei)抑(yi)制(zhi)劑(ji)，但(dan)不(bu)能影響(xiang)目(mu)的蛋白與(yu)樹(shu)脂(zhi)的結合）。

3）將菌(jun)體(ti)沈澱(dian)懸浮(fu)起(qi)來，（如(ru)果(guo)菌液濃度高(gao)，也可考(kao)慮(lv)加入10 μg/ml RNaseA和5ug/mlDNase I），濕(shi)勻，放置於(yu)冰(bing)上(shang)，然(ran)後(hou)冰上超(chao)聲破碎細胞，至菌液基本(ben)保持(chi)澄(cheng)清。

4）將澄(cheng)清(qing)的破碎液轉(zhuan)移至離(li)心(xin)管(guan)中(zhong)，10，000 rpm（15，000xg），4℃離(li)心(xin)20-30 min。取(qu)上(shang)清，置於(yu)冰(bing)上(shang)備(bei)用(yong)或-20℃保存。

2.2.2 酵母、昆(kun)蟲(chong)和哺乳(ru)細胞(bao)分(fen)泌(mi)表(biao)達可溶性蛋白

1）將細(xi)胞(bao)培養(yang)液轉(zhuan)移至高心(xin)杯，5，000 pm（3，800xg），離(li)心(xin)10 min，收(shou)集菌體得(de)上(shang)清(qing)，如上(shang)清(qing)中(zhong)不(bu)含EDTA、組氨(an)酸(suan)和還原劑(ji)等(deng)物(wu)質(zhi)，即可直接加(jia)入(ru)柱(zhu)子使用(yong)；如含(han)有EDTA、組氨(an)酸(suan)和還原劑(ji)等(deng)物(wu)質(zhi)，需(xu)用(yong)Lysis Buffer透析才(cai)能(neng)加入(ru)柱(zhu)子。

2）對於(yu)大(da)量(liang)體積(ji)的上清，需(xu)加入(ru)硫(liu)酸(suan)銨沈澱(dian)濃縮(suo)後(hou)，蛋白還(hai)需(xu)用(yong)Lysis Buffer透析後(hou)才(cai)能加(jia)入(ru)柱(zhu)子。

2.2.3包涵體蛋白純化（變性(xing)條件(jian)）

1）將培養(yang)液轉(zhuan)移到離(li)心(xin)杯(bei)中(zhong)，7，000 rpm（7，500xg），離(li)心(xin)15min收(shou)集菌體，去(qu)掉上清(qing)。

2）按照(zhao)菌體∶Lysis buffer（不(bu)含8M尿素）=1∶10（W/）將菌(jun)體(ti)懸浮(fu)起(qi)來混(hun)勻，冰浴超(chao)聲破碎。

3）將破碎液轉(zhuan)移至離(li)心(xin)管(guan)中(zhong)，10，000 rpm（15，000×g），4℃離(li)心(xin)20-30min。去(qu)掉上清(qing)，步驟(zhou)2和3可以(yi)重復(fu)壹次。4）按照(zhao)菌體∶Lysis buffer（含(han)8M尿(niao)素）=1∶10（W/V）將包(bao)涵體懸浮(fu)起(qi)來。5）變(bian)性(xing)條件下進行His標(biao)簽蛋白純化，具體(ti)緩沖(chong)液配(pei)方(fang)見表(biao)4、表(biao)5。2.3NiNTABeads重(zhong)力柱(zhu)的裝填

1）取(qu)合(he)適規(gui)格(ge)的重力層(ceng)析柱(zhu)，裝入下墊(dian)片，加入(ru)適量(liang)純水(shui)潤洗(xi)柱(zhu)管和墊片(pian)，關閉下出(chu)口。

2）將NiNTABeads混(hun)合(he)均勻，用(yong)槍頭吸(xi)取(qu)適量(liang)漿液加(jia)入(ru)至重力(li)柱(zhu)中（介質(zhi)實(shi)際體積占(zhan)懸液的(de)壹(yi)半），打(da)開下出(chu)口流幹(gan)保護(hu)液。3）加(jia)入(ru)適量(liang)純水(shui)沖(chong)洗介質(zhi)，待(dai)柱(zhu)管中液體(ti)重(zhong)力流幹(gan)後(hou)，關(guan)閉下出(chu)口。

4）裝入(ru)潤洗(xi)後(hou)的(de)上(shang)墊片(pian)，確(que)保墊(dian)片(pian)與(yu)填(tian)料之前沒(mei)有空(kong)隙，且保持(chi)水(shui)平。

5）裝(zhuang)填好的重(zhong)力(li)柱(zhu)可以(yi)直接加(jia)入(ru)平衡液進行平衡，暫不(bu)使用(yong)時(shi)則(ze)加入(ru)保護(hu)液，4-30℃保存。

2.4樣(yang)品純化流程

2.4.1 孵育(yu)法純化

1）根據(ju)純化的樣(yang)品量(liang)，取(qu)適量(liang)Ni NTA Beads加入(ru)離(li)心(xin)管(guan)中(zhong)，1000 rpm離(li)心(xin)1min，吸(xi)棄(qi)上清(qing)；也可加(jia)入重(zhong)力柱(zhu)中，流幹(gan)保護(hu)液。

2）向(xiang)離(li)心(xin)管(guan)中(zhong)加入5倍介質(zhi)體(ti)積的LysleBuffer清洗(xi)介質(zhi)，1000 rpm 離(li)心(xin)1min，吸(xi)棄(qi)上清(qing)如使用(yong)重力(li)柱(zhu)，則(ze)直接在(zai)重(zhong)力柱(zhu)中清洗，直接重(zhong)力(li)流幹(gan)Lysis Buffer重(zhong)復(fu)兩(liang)次(ci)以上(shang)。

3）加入(ru)樣(yang)品，封閉離(li)心(xin)管(guan)或重(zhong)力柱(zhu)管，4℃振(zhen)蕩(dang)孵(fu)育(yu)2-4h或者(zhe)37℃孵育(yu)30min-2h。

4） 孵育(yu)結束後(hou)，1000 rpm離(li)心(xin)1min，吸(xi)棄(qi)上清(qing)，或過(guo)濾收(shou)集介質(zhi)，上(shang)清保留(liu)作(zuo)為流穿，用(yong)於(yu)電泳鑒(jian)定(ding)。

5）用(yong)5倍介質(zhi)體(ti)積的WashBuffer清洗(xi)介質(zhi)，1000rpm 離(li)心(xin)1min 或重(zhong)力柱(zhu)管過濾，去(qu)除上清（註意不(bu)要吸(xi)到介質(zhi)），重(zhong)復3-5次，中間(jian)建(jian)議更換新離(li)心(xin)管(guan)。必要時(shi)可以(yi)調(tiao)整咪(mi)唑(zuo)的(de)濃度進行洗雜(za)。

6）加(jia)入(ru)3-5倍(bei)柱(zhu)體積的Eltton Buffer進行洗脫(tuo)，寬溫(wen)孵(fu)育(yu)10-15min，1000 rpm高心(xin)1mln或重(zhong)力柱(zhu)管收(shou)集洗脫(tuo)液，可重(zhong)復2-3次(ci)；

2.4.2重力柱(zhu)法純化

1）將裝(zhuang)填(tian)好的(de)NINTABeads重力柱(zhu)用(yong)5倍柱(zhu)體積LyslsBuffer進行平衡，使填料(liao)處於(yu)與(yu)目(mu)的蛋白相(xiang)同的緩沖(chong)液體(ti)系(xi)下，重(zhong)復(fu)2-3次(ci)。

2）將樣(yang)品加到平衡好的重(zhong)力(li)柱(zhu)中，樣(yang)品保留(liu)時(shi)間(jian)至少(shao)2 min;保證樣(yang)品和介質(zhi)充(chong)分接觸(chu)，收(shou)集流出(chu)液，可以(yi)反復(fu)上(shang)樣(yang)增加(jia)結合效率(lv)。3）用(yong) 10-15 倍柱(zhu)體積的Wash Buffer 進行洗雜(za)、夫(fu)除非(fei)特(te)導性(xing)吸(xi)附(fu)的(de)雜(za)蛋白，收(shou)集洗雜(za)液。必要時(shi)可以(yi)調(tiao)整咪(mi)唑(zuo)的(de)木(mu)度(du)進行洗先雜(za)。

4）使(shi)用(yong)5-10倍柱(zhu)體積的 Elution Buffer 洗(xi)脫(tuo)，分段(duan)收(shou)集，每(mei)壹(yi)個柱(zhu)體積收(shou)集壹管，分(fen)別檢測，既(ji)可以(yi)保證所有結(jie)合(he)的目(mu)的蛋白被(bei)洗脫(tuo)，又

可以(yi)得到高(gao)純度(du)和高濃度的(de)蛋白。

上(shang)述步驟介質(zhi)洗(xi)尚結束後(hou)，先用(yong)Lysis Buffer 沖(chong)洗3 倍(bei)柱(zhu)體積.然後(hou)用(yong)純水(shui)沖(chong)洗5倍(bei)柱(zhu)體積，再用(yong) 20%乙(yi)醇(chun)沖(chong)洗2個柱(zhu)體積，然後(hou)將介質(zhi)置於(yu)2-8℃保存。2.5 SDSPAGE 檢測

將使(shi)用(yong)純化產(chan)品得到的(de)樣(yang)品（包括(kuo)流出(chu)組分(fen)、洗(xi)雜(za)組分(fen)和洗脫(tuo)組分(fen)）以(yi)及原始樣(yang)品使用(yong) SDS-PAGE檢測結化效果(guo)。

3.在位清洗(xi)

當(dang)填料使(shi)用(yong)過程中發現(xian)反壓(ya)過(guo)高或者(zhe)填料上(shang)面出(chu)現(xian)明(ming)顯(xian)的(de)汙(wu)染(ran)時(shi)，需(xu)要進行在位清洗(xi)操作(zuo)（Cleaning-in-Place，CIP）。建(jian)議按(an)照(zhao)下(xia)面操作(zuo)去(qu)除填料上(shang)殘(can)留(liu)的汙(wu)染(ran)物(wu)，如沈(chen)澱蛋白、疏(shu)水蛋白和脂(zhi)蛋白等(deng)。去(qu)除強疏水(shui)結(jie)合(he)的蛋白，脂(zhi)蛋白和脂(zhi)類(lei)

通(tong)過使用(yong) 30%異丙醇(chun)清洗(xi) 5-10個柱(zhu)體積，接觸(chu)時(shi)間(jian)為(wei) 15-20 min 可以(yi)去(qu)除此(ci)類(lei)汙(wu)染(ran)物(wu)。然後(hou)，再使(shi)用(yong) 10倍柱(zhu)體積的去(qu)離(li)子(zi)水(shui)清(qing)洗。也可以(yi)選擇使(shi)用(yong)含有去(qu)汙(wu)劑(ji)的(de)酸(suan)性或堿(jian)性溶液，清(qing)洗(xi)填料(liao)2倍(bei)柱(zhu)體積。例如(ru)，含(han)有0.1-0.5%非(fei)離(li)子(zi)去(qu)汙(wu)劑(ji)的(de)0.1M醋(cu)酸溶液，接觸(chu)時(shi)間(jian)為(wei) 1-2 h。去(qu)汙(wu)劑(ji)處理後(hou)，需(xu)要使(shi)用(yong) 70%的乙(yi)醇(chun)清洗(xi)5個柱(zhu)體積，以*去(qu)除去(qu)汙(wu)劑(ji)。最(zui)後(hou)使用(yong) 10倍柱(zhu)體積的去(qu)離(li)子(zi)水(shui)清(qing)洗。去(qu)除離(li)子(zi)作(zuo)用(yong)結合(he)的蛋白

使(shi)用(yong) 1.5 M NaCI溶液清(qing)洗(xi) 10-15 min。然後(hou)，再(zai)使(shi)用(yong)去(qu)離(li)子(zi)水(shui)清(qing)洗 10個柱(zhu)體積。

4.填料(liao)再生

組氨(an)酸(suan)標(biao)簽蛋白親(qin)和純化填料(liao)所帶的(de)鎳(nie)離(li)子(zi)不(bu)需(xu)要經(jing)常(chang)螯(ao)合去(qu)除和重新(xin)掛鎳(nie)離(li)子(zi)。當(dang)填(tian)料使用(yong)過程中發現(xian)顏(yan)色變(bian)淺，或者(zhe)填料載量(liang)明(ming)顯(xian)變(bian)低(di)時(shi)，需(xu)要進行對填(tian)料(liao)進行簇離(li)子(zi)剝(bo)離(li)和重新(xin)掛鎳(nie)離(li)子(zi)，也(ye)就(jiu)是填料再牛(niu)。將填(tian)料(liao)裝填(tian)在合適的(de)層(ceng)柱(zhu)內(nei)，按(an)照(zhao)下(xia)面操作(zuo)流程進行鎳(nie)離(li)子(zi)剝(bo)離(li)和重新(xin)掛鎳(nie)離(li)子(zi)。

1）使(shi)用(yong)5倍柱(zhu)體積去(qu)離(li)子(zi)水(shui)清(qing)洗填料;

2）使用(yong)5倍柱(zhu)體積100 mM EDTA（pH 8.0）剝(bo)落鎳(nie)離(li)子(zi);

3）使(shi)用(yong) 10倍柱(zhu)體積去(qu)離(li)子(zi)水(shui)清(qing)洗填料;

4）使用(yong)0.5 M NaOH清洗(xi)5倍柱(zhu)體積，停留(liu) 10-15 min;

5）使用(yong)去(qu)離(li)子(zi)水(shui)清(qing)洗填料，直至 pH中性(xing);

6）使用(yong)3-5倍柱(zhu)體積 100mM NiSO4再生掛鎳(nie);

7）使(shi)用(yong)10倍柱(zhu)體積去(qu)離(li)子(zi)水(shui)清(qing)洗;

填料再生後(hou)，可以(yi)立即使用(yong)，如不(bu)立即使用(yong)，需(xu)要將填(tian)料(liao)懸浮(fu)於(yu)等(deng)體(ti)積的(de) 20%乙(yi)醇(chun)中，置於(yu)4-30°℃保存。

     蘇(su)州(zhou)阿(e)爾法(fa)生物(wu)提供(gong)的瓊(qiong)脂(zhi)糖凝膠(jiao)介質(zhi)、葡(pu)聚糖凝膠(jiao)介質(zhi)等(deng)蛋白純化和分離(li)填(tian)料(liao)以(yi)及相關生物(wu)試(shi)劑(ji)。另(ling)外(wai)還提(ti)供(gong)、氨(an)酸(suan)標(biao)簽蛋白親(qin)和純化介質(zhi)、GST-tag蛋白親(qin)和純化介質(zhi)、 MBP-tag蛋白親(qin)和純化介質(zhi)、Biotin-tag蛋白親(qin)和純化介質(zhi)、Strep-tagll標(biao)簽親和純化介質(zhi)、 標(biao)簽抗體親和純化介質(zhi)等(deng)標(biao)簽蛋白親(qin)和層(ceng)析介質(zhi)； 離(li)子(zi)交換層(ceng)析 、色譜(pu)柱(zhu)、離(li)子(zi)交換層(ceng)析樹(shu)脂(zhi)、疏水層(ceng)析介質(zhi)、 磁(ci)性微球等(deng)。