重(zhong)組(zu)克(ke)隆(long)的(de)篩(shai)選(xuan)與鑒(jian)定(ding)

重(zhong)組(zu)克(ke)隆(long)的(de)篩(shai)選(xuan)與鑒(jian)定(ding)

壹、實驗(yan)目(mu)的(de)

通(tong)過(guo)篩(shai)選(xuan)，獲(huo)得含目(mu)的(de)片段(duan)的(de)重(zhong)組(zu)克(ke)隆(long)。掌(zhang)握利用酶(mei)切(qie)或(huo)PCR方(fang)法(fa)進(jin)行陽性(xing)克隆的(de)篩(shai)選(xuan)與鑒(jian)定(ding)步驟(zhou)。

二(er)、實驗原理(li)

藍白斑篩(shai)選(xuan)是重(zhong)組(zu)子(zi)篩(shai)選(xuan)的(de)壹種(zhong)方法(fa)，根(gen)據載體的(de)遺傳(chuan)特征篩(shai)選(xuan)重(zhong)組(zu)子(zi)，如(ru)α-互補(bu)、抗生素基(ji)因等(deng)。現在(zai)使用(yong)的(de)許(xu)多載體都(dou)帶有壹個大(da)腸(chang)桿菌(jun)的(de)DNA的(de)短(duan)區段(duan)，其中有β-半(ban)乳(ru)糖苷(gan)酶基因（lacZ）的(de)調(tiao)控序(xu)列(lie)和前146個(ge)氨基(ji)酸(suan)的(de)編(bian)碼信息。在(zai)這(zhe)個編(bian)碼區中插入(ru)了(le)壹個多克(ke)隆位(wei)點（MCS），它並(bing)不破(po)壞讀框，但可使(shi)少數(shu)幾個氨基(ji)酸(suan)插(cha)入到β-半(ban)乳(ru)糖苷(gan)酶的(de)氨基(ji)端(duan)而(er)不影(ying)響(xiang)功能(neng)，這(zhe)種(zhong)載體適用(yong)於(yu)可(ke)編(bian)碼β-半(ban)乳(ru)糖苷(gan)酶C端(duan)部(bu)分序列(lie)的(de)宿主細胞(bao)。因此(ci)，宿主和質(zhi)粒編(bian)碼的(de)片段(duan)雖(sui)都(dou)沒(mei)有(you)酶活(huo)性(xing)，但它們(men)同(tong)時存在時，可(ke)形(xing)成(cheng)具有(you)酶學(xue)活(huo)性(xing)的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)。這樣，lacZ基(ji)因在(zai)缺少近操(cao)縱(zong)基因區段(duan)的(de)宿主細胞(bao)與帶有完整(zheng)近操(cao)縱(zong)基因區段(duan)的(de)質(zhi)粒(li)之間(jian)實現(xian)了(le)互補(bu)，稱(cheng)為(wei)α-互補(bu)。由(you)α-互補(bu)而(er)產(chan)生的(de)LacZ+細菌(jun)在誘導(dao)劑IPTG的(de)作用下(xia)，在生色(se)底(di)物X-Gal存在時產(chan)生藍色(se)菌(jun)落(luo)，因而(er)易(yi)於(yu)識別。然而(er)，當(dang)外源(yuan)DNA插(cha)入到質(zhi)粒(li)的(de)多克(ke)隆位(wei)點後(hou)，幾乎不可(ke)避(bi)免(mian)地(di)導(dao)致無(wu)α-互補(bu)能(neng)力(li)的(de)氨基(ji)端(duan)片段(duan)，使(shi)得帶有重(zhong)組(zu)質(zhi)粒(li)的(de)細菌(jun)形(xing)成(cheng)白色(se)菌(jun)落(luo)。這(zhe)種(zhong)重(zhong)組(zu)子(zi)的(de)篩(shai)選(xuan)，又稱為(wei)藍白斑篩(shai)選(xuan)。如用藍白斑篩(shai)選(xuan)則經連(lian)接(jie)產(chan)物轉(zhuan)化(hua)的(de)鈣(gai)化(hua)菌(jun)平板37℃溫(wen)箱倒(dao)置(zhi)培(pei)養(yang)12-16hr後(hou)，有重(zhong)組(zu)質(zhi)粒(li)的(de)細菌(jun)形(xing)成(cheng)白色(se)菌(jun)落(luo)。 

由(you)於(yu)pUC質(zhi)粒帶有氨芐(bian)青黴(mei)素抗性(xing)基因(Amp^r)，可(ke)通(tong)過(guo)Amp抗性(xing)來篩(shai)選(xuan)轉化(hua)子。受(shou)體細胞(bao)沒(mei)有(you)轉入(ru)pUC，則在(zai)含(han)Amp的(de)培(pei)養(yang)基上(shang)不能(neng)生長。能(neng)在(zai)Amp培(pei)養(yang)基上(shang)生長的(de)受(shou)體細胞(bao)（轉化(hua)子）肯(ken)定(ding)已導(dao)入了(le)pUC。轉(zhuan)化(hua)子擴(kuo)增後，可將(jiang)轉化(hua)的(de)質(zhi)粒(li)提(ti)取(qu)出(chu)，進(jin)行酶切(qie)或(huo)PCR等(deng)進(jin)壹步鑒(jian)定(ding)。                   

三(san)、主要試劑

胰(yi)蛋(dan)白(bai)腖(dong)、酵母粉(fen)、瓊脂(zhi)、Amp、IPTG、X-Gal

四(si)、儀器(qi)耗(hao)材(cai)

超(chao)凈(jing)工作臺、培(pei)養(yang)箱、平皿(min)、移(yi)液器(qi)、tip。

五、實驗(yan)步(bu)驟   

1. 記(ji)錄(lu)樣品的(de)轉(zhuan)化(hua)子總數(shu)，白(bai)色(se)和藍色(se)菌(jun)落(luo)各(ge)有(you)多少。

2. 記(ji)錄(lu)對(dui)照2的(de)菌(jun)落(luo)數(shu)，計(ji)算(suan)陽性(xing)對(dui)照的(de)轉(zhuan)化(hua)頻(pin)率。

3. 挑(tiao)取(qu)壹個白(bai)色(se)菌(jun)落(luo)，接(jie)於(yu)2mL的(de)LB中

4. 37℃培(pei)養(yang)過(guo)夜。

5. 快速(su)堿裂解法(fa)抽提(ti)質(zhi)粒，具(ju)體方(fang)法(fa)參見同(tong)實驗二(er)。

6. 酶(mei)切，同(tong)時以(yi)提取(qu)的(de)質(zhi)粒(li)作對(dui)照，具(ju)體方(fang)法(fa)參見實(shi)驗(yan)三(san)。

取(qu)2μL質(zhi)粒進(jin)行雙(shuang)酶(mei)切(qie)，酶(mei)切體系(xi)如下：10×bf 2μL，限(xian)制酶各(ge)0.5μL，H₂O 15μL。37度(du)，2-4hr。0.8-1%瓊脂(zhi)糖(tang)電(dian)泳檢測(ce)。

    7. 或(huo)者使(shi)用(yong)PCR鑒(jian)定(ding)陽性(xing)克隆，具(ju)體方(fang)法(fa)參見實(shi)驗(yan)壹。

六、註(zhu)意(yi)事項(xiang)

1. IPTG和X-Gal在(zai)培(pei)養(yang)基上(shang)壹定(ding)要塗(tu)勻。

2. 平板如(ru)在(zai)培(pei)養(yang)後放(fang)於(yu)冰(bing)箱3-4小時可(ke)使(shi)顯(xian)色(se)反應充(chong)分，藍色(se)菌(jun)落(luo)明顯(xian)。 

思(si)考題：

1. 如(ru)果壹個DNA 酶(mei)解液在電(dian)泳後發現(xian)DNA 未(wei)被(bei)切動，妳(ni)認(ren)為(wei)可能(neng)是(shi)什(shen)麽原因？

2. 請(qing)分析實(shi)驗(yan)結果出現假(jia)陽性(xing)的(de)具(ju)體原因。

3. 實(shi)驗結果與分析：如(ru)果電(dian)泳後（1）只有載體條(tiao)帶，看不到插(cha)入(ru)片段(duan)的(de)條(tiao)帶？（2）出(chu)現2條(tiao)以(yi)上的(de)條(tiao)帶？如(ru)何解釋(shi)。

4. 本(ben)實驗的(de)目(mu)的(de)是(shi)克(ke)隆(long)基因Xbc，為(wei)基因表(biao)達(da)做準(zhun)備。妳(ni)認(ren)為(wei)經過(guo)酶(mei)切鑒(jian)定(ding)是否(fou)獲(huo)得了(le)Xbc的(de)陽性(xing)克隆？為(wei)什(shen)麽？並(bing)寫出(chu)後續(xu)的(de)實(shi)驗(yan)步(bu)驟或(huo)計(ji)劃(hua)。

蘇州阿(e)爾(er)法(fa)生物是(shi)壹家集(ji)生命科學儀器(qi)設(she)備(bei)、實驗耗(hao)材(cai)和實(shi)驗試劑供(gong)應於(yu)壹身的(de)專業(ye)公(gong)司。阿(e)爾(er)法(fa)生物產(chan)品覆(fu)蓋(gai)生命科學研究、生物制(zhi)藥(yao)、環(huan)境監測(ce)、食品安全(quan)等(deng)領(ling)域，包括(kuo)的(de)實(shi)驗(yan)室儀(yi)器(qi)設(she)備(bei)有(you)生物顯(xian)微(wei)鏡(jing)、細胞(bao)培(pei)養(yang)系統(tong)、蛋(dan)白(bai)電(dian)泳系統(tong)、數(shu)字PCR儀、高(gao)通(tong)量(liang)分析儀(yi)、高(gao)速冷凍(dong)離心(xin)機(ji)、超(chao)速離心(xin)機(ji)、臺(tai)式高(gao)速離心(xin)機(ji)、低速(su)離心(xin)機(ji)、落(luo)地(di)式(shi)離心(xin)機(ji)、迷(mi)妳離心(xin)機(ji)、真(zhen)空(kong)濃縮(suo)儀、恒溫(wen)恒濕(shi)培(pei)養(yang)箱、生物反(fan)應器(qi)、細菌(jun)培(pei)養(yang)箱研(yan)磨(mo)儀等，實(shi)驗(yan)耗(hao)材(cai)常(chang)用的(de)nest培(pei)養(yang)瓶、rainin移(yi)液槍tip頭、離心(xin)管(guan)、PCR管(guan)、8聯(lian)排管、三(san)角(jiao)搖瓶、培(pei)養(yang)皿等(deng)，實(shi)驗(yan)試劑包括(kuo)天(tian)根(gen)試劑盒(he)、質(zhi)粒抽提(ti)試劑盒(he)、蛋(dan)白抗體、碧(bi)雲天(tian)試劑、阿(e)拉(la)丁(ding)試劑、腫(zhong)瘤細胞(bao)株、基(ji)因編(bian)輯細胞(bao)、支(zhi)原體清(qing)除(chu)試劑盒(he)等。阿(e)爾(er)法(fa)生物壹直與國(guo)際(ji)生命科學儀(yi)器(qi)廠商(shang)以(yi)及(ji)壹些(xie)新興(xing)科技公(gong)司保(bao)持(chi)著(zhe)深度的(de)合(he)作關系(xi)，這(zhe)也為(wei)產(chan)品供應和技術支(zhi)持(chi)提(ti)供了(le)有(you)力(li)保(bao)障。 作為(wei)十(shi)四(si)年(nian)年(nian)專註(zhu)於(yu)實(shi)驗室儀(yi)器(qi)設(she)備(bei)、實驗耗(hao)材(cai)和實(shi)驗試劑供(gong)應商，無(wu)論是實驗室的(de)常(chang)規使用，還(hai)是(shi)科(ke)研(yan)人員(yuan)的(de)前沿(yan)探(tan)索(suo)，阿(e)爾(er)法(fa)生物都(dou)能(neng)夠(gou)為(wei)您提供(gong)良好(hao)的(de)軟(ruan)硬(ying)件(jian)支(zhi)持(chi)和快捷、周到的(de)服(fu)務。更多實(shi)驗室儀(yi)器(qi)、實驗(yan)試劑、實(shi)驗室耗(hao)材(cai)采購(gou)相(xiang)關(guan)問(wen)題(ti)可(ke)以(yi)進(jin)入蘇州阿(e)爾(er)法(fa)生物進(jin)行了(le)解(jie)。