研究生實(shi)驗-大(da)腸(chang)桿菌感(gan)受態(tai)細胞的(de)制(zhi)備(bei)及質粒(li)轉(zhuan)化(hua)

大(da)腸(chang)桿菌感(gan)受態(tai)細胞的(de)制(zhi)備(bei)及質粒(li)轉(zhuan)化(hua)

壹(yi)、實(shi)驗目(mu)的(de)

    通(tong)過(guo)本(ben)實(shi)驗，掌(zhang)握大腸(chang)桿菌感(gan)受態(tai)細胞的(de)制(zhi)備(bei)及轉(zhuan)化(hua)的(de)方(fang)法和技(ji)術。獲得感受態(tai)細胞；制(zhi)備(bei)含(han)有目(mu)的(de)片(pian)段(duan)的(de)陽(yang)性(xing)克(ke)隆。

二(er)、實(shi)驗原(yuan)理

轉(zhuan)化(hua)(Transformation)是(shi)將外源(yuan)DNA分子引(yin)入(ru)受體細胞，使之獲得新的(de)遺(yi)傳性(xing)狀(zhuang)的(de)壹(yi)種手段(duan)，它是(shi)微(wei)生(sheng)物(wu)遺(yi)傳、分子遺(yi)傳、基因(yin)工程等(deng)研究領域(yu)的(de)基本(ben)實(shi)驗技(ji)術。

轉(zhuan)化(hua)過程所(suo)用的(de)受體細胞壹(yi)般是(shi)限(xian)制(zhi)修飾系統缺陷的(de)變(bian)異株，即(ji)不含(han)限(xian)制(zhi)性(xing)內(nei)切酶和甲基化(hua)酶的(de)突變體(Rˉ，Mˉ)，它(ta)可以容忍外源(yuan)DNA分子進(jin)入(ru)體內(nei)並(bing)穩定(ding)地(di)遺(yi)傳給後(hou)代。受體細胞經(jing)過(guo)壹(yi)些特殊方(fang)法(如(ru)電(dian)擊(ji)法(fa)，CaCl₂，RbCl (KCl) 等(deng)化(hua)學試(shi)劑法(fa)的(de)處(chu)理後(hou)，細胞膜的(de)通(tong)透(tou)性(xing)發(fa)生了(le)暫(zan)時性(xing)的(de)改(gai)變，成(cheng)為能(neng)允許外源(yuan)DNA分子進(jin)入(ru)的(de)感(gan)受態(tai)細胞 (Compenent cells)。進(jin)入(ru)受體細胞的(de)DNA分子通過復制(zhi)，表(biao)達(da)實(shi)現遺(yi)傳信息的(de)轉(zhuan)移，使受體細胞出現新(xin)的(de)遺(yi)傳性(xing)狀(zhuang)。將經(jing)過(guo)轉(zhuan)化(hua)後(hou)的(de)細胞在篩選(xuan)培(pei)養(yang)基中培(pei)養，即(ji)可篩選(xuan)出轉(zhuan)化(hua)子(Transformant，即(ji)帶有異源(yuan)DNA分子的(de)受體細胞)。CaCl₂ 法(fa)簡(jian)便(bian)易(yi)行，且(qie)其(qi)轉(zhuan)化(hua)效(xiao)率全可以滿足壹(yi)般實(shi)驗的(de)要(yao)求(qiu)，制(zhi)備(bei)出的(de)感(gan)受態(tai)細胞暫時不(bu)用時(shi)，可加入(ru)占總體積15％的(de)無(wu)菌甘(gan)油於-70℃保(bao)存(cun)(半(ban)年(nian))，因(yin)此(ci)CaCl₂法(fa)使(shi)用更(geng)廣泛(fan)。

轉(zhuan)化(hua)率的(de)計算：

統(tong)計培養(yang)皿中的(de)轉(zhuan)化(hua)子數(shu)，轉(zhuan)化(hua)後(hou)在抗生素的(de)平(ping)板上(shang)長(chang)出的(de)菌落(luo)即(ji)為轉(zhuan)化(hua)子。

轉(zhuan)化(hua)子總數(shu)=菌落(luo)數(shu)×稀(xi)釋倍數(shu)（轉(zhuan)化(hua)反應(ying)原(yuan)液(ye)總體積 / 塗板菌液(ye)體積）

轉(zhuan)化(hua)頻(pin)率（轉(zhuan)化(hua)子個數(shu)/每μg質粒(li)DNA）= 對(dui)照2轉(zhuan)化(hua)子總數(shu) / 質粒(li)DNA加(jia)入(ru)量（μg）

感(gan)受態(tai)細胞總數(shu)= 對(dui)照1菌落(luo)數(shu)×稀(xi)釋倍數(shu)

感(gan)受態(tai)細胞轉(zhuan)化(hua)效(xiao)率= 轉(zhuan)化(hua)子總數(shu) / 感(gan)受態(tai)細胞總數(shu)

為(wei)了(le)提高(gao)轉(zhuan)化(hua)效(xiao)率，實(shi)驗中(zhong)要(yao)考(kao)慮以下(xia)幾個重要(yao)因(yin)素(su)：

1. 細胞生長(chang)狀(zhuang)態(tai)和密度: 不(bu)要(yao)用經(jing)過(guo)多次轉(zhuan)接(jie)或儲(chu)於４℃的(de)培(pei)養菌，最(zui)好(hao)從(cong)-70℃或(huo)-20℃甘(gan)油保存(cun)的(de)菌種(zhong)中直接(jie)轉(zhuan)接(jie)用於(yu)制(zhi)備(bei)感(gan)受態(tai)細胞的(de)菌液(ye)。細胞生長(chang)密度以剛(gang)進(jin)入(ru)對數(shu)生(sheng)長(chang)期時(shi)為好(hao)，可通過監測培養液(ye)的(de)OD600 來(lai)控(kong)制(zhi)。密度過高(gao)或不(bu)足均(jun)會影響轉(zhuan)化(hua)效(xiao)率。

2. 質粒(li)的(de)質量和濃(nong)度(du): 用於(yu)轉(zhuan)化(hua)的(de)質粒(li)DNA應(ying)主(zhu)要(yao)是(shi)超螺(luo)旋(xuan)態(tai)DNA(cccDNA)。轉(zhuan)化(hua)效(xiao)率與外源(yuan)DNA的(de)濃(nong)度在壹(yi)定(ding)範(fan)圍(wei)內(nei)成(cheng)正(zheng)比，但(dan)當加入(ru)的(de)外源(yuan)DNA的(de)量過多或體積過(guo)大時(shi)，轉(zhuan)化(hua)效(xiao)率就會降(jiang)低(di)。1ng的(de)cccDNA即(ji)可使50μL的(de)感(gan)受態(tai)細胞達(da)到(dao)飽和。壹(yi)般情(qing)況(kuang)下，DNA溶(rong)液(ye)的(de)體積不(bu)應超過(guo)感(gan)受態(tai)細胞體積的(de)5％。

3. 試(shi)劑(ji)的(de)質量: 所(suo)用的(de)試(shi)劑，如CaCl₂ 等(deng)均(jun)需是(shi)最(zui)高(gao)純(chun)度的(de)(GR.或(huo)AR.)，並(bing)用超純(chun)水(shui)配制(zhi)，最(zui)好(hao)分裝(zhuang)保存(cun)於幹(gan)燥的(de)冷(leng)暗(an)處(chu)。

4. 防止雜(za)菌和雜(za)DNA的(de)汙染：整(zheng)個操作(zuo)過(guo)程均(jun)應在無菌條(tiao)件(jian)下(xia)進(jin)行(xing)，所(suo)用器(qi)皿(min)，如離心(xin)管，tip頭等(deng)最(zui)好(hao)是(shi)新的(de)，並(bing)經(jing)高(gao)壓滅(mie)菌處(chu)理，所有的(de)試(shi)劑都要(yao)滅(mie)菌，且(qie)註意防止被其(qi)它試劑、DNA酶或(huo)雜(za)DNA所(suo)汙染，否(fou)則均(jun)會影響轉(zhuan)化(hua)效(xiao)率或雜(za)DNA的(de)轉(zhuan)入(ru)，為以(yi)後(hou)的(de)篩選(xuan)、鑒(jian)定(ding)帶(dai)來不必要(yao)的(de)麻(ma)煩。

本(ben)實(shi)驗以(yi)E.coli TOP-10菌株(zhu)為受體細胞，並用CaCl₂處(chu)理(li)，使(shi)其(qi)處於感受態(tai)，然後(hou)與pUC質粒(li)共(gong)保溫(wen)，實(shi)現轉(zhuan)化(hua)。由於(yu)pUC質粒(li)帶有氨芐青(qing)黴素(su)抗(kang)性(xing)基因(yin) (Amp^r)，可通過Amp抗(kang)性(xing)來(lai)篩選(xuan)轉(zhuan)化(hua)子。如受體細胞沒(mei)有轉(zhuan)入(ru)pUC，則在含(han)Amp的(de)培(pei)養基上不(bu)能生(sheng)長(chang)。能在Amp培(pei)養(yang)基上生(sheng)長(chang)的(de)受體細胞（轉(zhuan)化(hua)子）已導(dao)入(ru)了(le)pUC。

三(san)、主(zhu)要(yao)試(shi)劑(ji)

E.coli(Top-10, DH 5a)、CaCl₂、無(wu)菌水(shui)、胰(yi)蛋白腖、酵母粉、瓊脂、氨芐青(qing)黴素(su)。

四(si)、儀(yi)器(qi)耗材(cai)

控(kong)溫搖床(chuang)(37℃)、冷(leng)凍離(li)心(xin)機(ji)（50mL轉(zhuan)子）、水(shui)浴鍋(guo)、冰箱(xiang)（-20℃，-70℃）、超凈(jing)工作臺(tai)、培養(yang)箱(xiang)(37℃)、分光光度計、移液(ye)器(qi)、槍(qiang)頭、離心(xin)管、小(xiao)三(san)角(jiao)瓶(ping)、6cm平(ping)皿(min)、酒(jiu)精(jing)燈、三(san)角(jiao)玻(bo)棒(bang)、酒(jiu)精(jing)棉(mian)球、火(huo)柴

五、實(shi)驗步驟(zhou)

感(gan)受態(tai)細胞制(zhi)備(bei)：

1. 第(di)壹(yi)天：從(cong)大腸(chang)桿菌平(ping)板上(shang)挑(tiao)取壹(yi)個單菌落(luo)接(jie)於2 mL LB液(ye)體培(pei)養(yang)基的(de)試(shi)管中(zhong)，37℃振(zhen)蕩培(pei)養(yang)過夜(ye)。

    2. 第(di)二(er)天：取0.5 mL菌液(ye)轉(zhuan)接(jie)到壹(yi)個含(han)有50 mL LB液(ye)體培(pei)養(yang)基錐形(xing)瓶(ping)中，37℃振(zhen)蕩培(pei)養(yang)。2-3 h，測(ce)定(ding)OD600 ≤ 0.4-0.5，細胞數(shu)務(wu)必(bi) ≤10⁸／mL。（此(ci)為實(shi)驗成(cheng)功的(de)關(guan)鍵(jian))

3. 將菌液(ye)轉(zhuan)移到50 mL離(li)心(xin)管中(zhong)，冰上放(fang)置(zhi)10 min。

4. 離(li)心(xin)10 min，4000r/min，4℃，倒出培養(yang)液(ye)，將管倒置(zhi)1min以(yi)便(bian)培(pei)養液(ye)流盡(jin)，回(hui)收(shou)細胞。

5. 用冰(bing)冷的(de)0.1 mol/L CaCl₂ 10 mL懸(xuan)浮沈澱，立即(ji)放(fang)在冰上30 min。

6. 4℃ 6000 r/min，離(li)心(xin)10 min，回(hui)收(shou)細胞。

7. 用冰(bing)冷的(de)0.1mol/L CaCl₂ 2 mL懸(xuan)浮細胞，務必放(fang)在冰上。此(ci)細胞為感受態(tai)細胞。

8. 分裝(zhuang)，每管200 μL。可以加入(ru)15%甘(gan)油-70度(du)保(bao)存(cun)。

轉(zhuan)化(hua)：

9. 取200 μL新(xin)鮮(xian)制(zhi)備(bei)的(de)感(gan)受態(tai)細胞，加入(ru)連(lian)接(jie)產(chan)物(wu)10μL（~50 ng ）混勻(yun)冰上放(fang)置(zhi)30 min。

同(tong)時(shi)作(zuo)2個對照管：

對(dui)照1：200 μL感(gan)受態(tai)細胞＋ 10μL無菌水(shui)（不含(han)氨芐皿(min)）每班做(zuo)壹(yi)個

對照2：200 μL 感(gan)受態(tai)細胞＋ 1μL 標準質粒(li)DNA溶液(ye)（10ng/μL）每班做(zuo)1-3個

10. 將管放(fang)到(dao)42℃循(xun)環(huan)水(shui)浴90-120sec。

11. 冰浴2 min。（提前準備(bei)好(hao)）

12. 每管加(jia)600 μL LB液(ye)體培(pei)養(yang)基，37℃培養(yang)1 h（慢搖(yao)）。

13. 將適當體積已轉(zhuan)化(hua)的(de)感(gan)受態(tai)細胞，離心(xin)後(hou)塗在含(han)有氨芐青(qing)黴素(su)的(de)培(pei)養皿中。（提前倒好(hao)平(ping)板）

註(zhu)意(yi)：對(dui)照1塗不(bu)加(jia)氨芐的(de)平(ping)皿(min)，菌液(ye)不離(li)心(xin)，取1-10μL塗；

對(dui)照2塗氨芐平(ping)皿(min)，菌液(ye)不離(li)心(xin)，取5-20μL塗。

14. 倒置(zhi)平(ping)皿(min)37℃培養(yang)12-16 h，出現菌落(luo)。

15. 計算陽(yang)性(xing)對(dui)照的(de)轉(zhuan)化(hua)頻(pin)率。

16. 記錄(lu)樣品(pin)的(de)轉(zhuan)化(hua)子總數(shu)。

六、註意事項

1. 無(wu)菌操(cao)作。

2. 低(di)溫操(cao)作。

3．註(zhu)意(yi)加(jia)Amp時(shi)的(de)溫(wen)度，溫度不能過(guo)高(gao)（55-60度(du)），否(fou)則抗(kang)生(sheng)素(su)失活(huo)，會使克(ke)隆株(zhu)無(wu)法(fa)篩選(xuan)出來。

 蘇州(zhou)阿(e)爾(er)法實(shi)驗器(qi)材(cai)有限(xian)公(gong)司(si)14年(nian)專(zhuan)註於生(sheng)物(wu)實(shi)驗室(shi)儀(yi)器(qi)設(she)備(bei)與(yu)實(shi)驗耗材(cai)和生(sheng)物(wu)試劑的(de)專(zhuan)業供(gong)應(ying)商(shang)，迄(qi)今(jin)為止已服(fu)務1000+客戶。主(zhu)要(yao)經(jing)營(ying)的(de)儀(yi)器(qi)類(lei)產(chan)品(pin)包括恒(heng)溫(wen)振(zhen)蕩培(pei)養(yang)箱 ，二(er)氧化(hua)碳(tan)搖(yao)床(chuang)，全(quan)溫(wen)振(zhen)蕩培(pei)養(yang)箱，振(zhen)蕩培(pei)養(yang)箱，Rainin移液(ye)器(qi)，培(pei)養箱，黴菌培(pei)養箱，生(sheng)物(wu)反應器(qi)，發(fa)酵罐(guan)，二(er)氧化(hua)碳(tan)培(pei)養箱(xiang)，液(ye)氮(dan)罐(guan)，超純(chun)水(shui)機(ji)，天平(ping)，離(li)心(xin)機(ji)、潔(jie)凈工作臺(tai)等(deng)。廠(chang)商企(qi)業(ye)授(shou)權包括知(zhi)楚儀(yi)器(qi)、朗(lang)基、中科(ke)美菱，梅(mei)特勒，樂(le)楓(feng)，搏旅、NEST、天根、奧(ao)盛等(deng)80余(yu)家(jia)。如需更(geng)多(duo)了(le)解(jie)進(jin)入(ru) 蘇州(zhou)阿(e)爾(er)法生物(wu)網站 進(jin)行(xing)咨詢。