分(fen)子(zi)生物(wu)學(xue)實驗(yan)-DNA重(zhong)組(zu)技(ji)術

DNA重(zhong)組技(ji)術（連接）

壹(yi)、實(shi)驗(yan)目(mu)的(de)

    體外連接獲得(de)重組分子(zi)，用於(yu)轉(zhuan)化(hua)受體細胞。

二、實驗(yan)原(yuan)理(li)

DNA重組技(ji)術是(shi)用內切酶分(fen)別(bie)將(jiang)載(zai)體和(he)外源DNA切開，經分離(li)純(chun)化(hua)後，用連接酶將其(qi)連接，構(gou)成新的(de)DNA分子。

外源DNA片段和(he)質粒載(zai)體的(de)連接反(fan)應策(ce)略有以(yi)下(xia)幾(ji)種：

1、帶(dai)有非(fei)互(hu)補突(tu)出(chu)端的(de)片段 用兩(liang)種(zhong)不(bu)同的(de)限(xian)制性(xing)內切酶進行消(xiao)化(hua)可以產(chan)生帶(dai)有非(fei)互(hu)補的(de)粘(zhan)性(xing)末端(duan)，這(zhe)也是(shi)最容(rong)易克(ke)隆(long)的(de)DNA片段，壹(yi)般情(qing)況下(xia)，常用質(zhi)粒載(zai)體均(jun)帶(dai)有多(duo)個不(bu)同限(xian)制酶的(de)識別(bie)序列(lie)組成(cheng)的(de)多克(ke)隆(long)位點(dian)，因而(er)幾(ji)乎(hu)總(zong)能(neng)找(zhao)到與外源DNA片段末端(duan)匹(pi)配的(de)限(xian)制酶切(qie)位點(dian)的(de)載(zai)體，從(cong)而(er)將外源片段定向地克(ke)隆(long)到載(zai)體上(shang)。也(ye)可在(zai)PCR擴增時(shi)，在(zai)DNA片段兩端(duan)人為加上(shang)不(bu)同酶(mei)切(qie)位點(dian)以(yi)便與載(zai)體相(xiang)連。

2、帶(dai)有相(xiang)同的(de)粘(zhan)性(xing)末端(duan) 用相(xiang)同的(de)酶或(huo)同尾(wei)酶(mei)處理(li)可得(de)到這樣的(de)末端(duan)。由(you)於質(zhi)粒載(zai)體也(ye)必須用同壹(yi)種(zhong)酶(mei)消(xiao)化(hua)，亦(yi)得(de)到同樣(yang)的(de)兩個相(xiang)同粘(zhan)性(xing)末端(duan)，因此(ci)在(zai)連接反(fan)應中外源片段和(he)質粒載(zai)體DNA均(jun)可能發(fa)生自身(shen)環(huan)化(hua)或(huo)幾(ji)個分(fen)子串(chuan)連形成寡(gua)聚(ju)物(wu)，而(er)且正(zheng)反(fan)兩種連接方向都(dou)可能有(you)。所(suo)以，必(bi)須(xu)仔(zai)細調整連接反(fan)應中兩種DNA的(de)濃(nong)度，以(yi)便使(shi)正(zheng)確的(de)連接產(chan)物(wu)的(de)數(shu)量達到高(gao)的(de)水平(ping)。還(hai)可將載(zai)體DNA的(de)5'磷(lin)酸(suan)基(ji)團(tuan)用堿性(xing)磷(lin)酸(suan)酯(zhi)酶(mei)去掉(diao)，MAX大(da)限(xian)度地抑制質(zhi)粒DNA的(de)自身(shen)環(huan)化(hua)。帶(dai)5'端磷(lin)酸(suan)的(de)外源DNA片段可以有(you)效(xiao)地與去磷(lin)酸(suan)化(hua)的(de)載(zai)體相(xiang)連，產(chan)生壹(yi)個帶(dai)有兩(liang)個缺口(kou)的(de)開環(huan)分(fen)子(zi)，在(zai)轉入(ru)E.coli受體菌後的(de)擴增過程(cheng)中缺口(kou)可自動(dong)修復。

3、帶(dai)有平(ping)末端(duan) 是(shi)由產(chan)生平(ping)末端(duan)的(de)限(xian)制酶或(huo)核酸(suan)外切酶消(xiao)化(hua)產(chan)生，或由DNA聚(ju)合酶補平(ping)所(suo)致。由(you)於(yu)平(ping)端的(de)連接效(xiao)率(lv)比(bi)粘(zhan)性(xing)末端(duan)要(yao)低得(de)多，故(gu)在(zai)其(qi)連接反(fan)應中，T₄ DNA連接酶的(de)濃(nong)度和(he)外源DNA及載(zai)體DNA濃(nong)度均(jun)要高(gao)得(de)多。通常還(hai)需加(jia)入(ru)低濃(nong)度的(de)聚(ju)乙(yi)二醇(PEG 8000)以促進DNA分子凝(ning)聚(ju)成(cheng)聚(ju)集(ji)體的(de)物(wu)質(zhi)以提高(gao)轉化(hua)效(xiao)率(lv)。

特殊情(qing)況下(xia)，外源DNA分子的(de)末端(duan)與所(suo)用的(de)載(zai)體末端(duan)無(wu)法相(xiang)互(hu)匹配(pei)，則可以在(zai)線(xian)狀(zhuang)質(zhi)粒載(zai)體末端(duan)或(huo)外源DNA片段末端(duan)接上(shang)合適的(de)接頭(linker)或銜接頭(adapter)使(shi)其(qi)匹(pi)配， 也可以有(you)控(kong)制的(de)使(shi)用E. coli DNA聚(ju)合酶Ⅰ的(de)klenow大(da)片段部分(fen)填(tian)平(ping)3'凹(ao)端，使(shi)不(bu)相匹配的(de)末端(duan)轉(zhuan)變為(wei)互(hu)補末端(duan)或(huo)轉為(wei)平(ping)末端(duan)後再(zai)進行連接。

三(san)、 主要試劑(ji)

　  T₄ 連接酶、無菌水、質(zhi)粒和(he)PCR的(de)酶切(qie)產(chan)物(wu)。

四(si)、儀器耗(hao)材

　  微(wei)量移液(ye)槍(qiang)，Tip、eppendorf管(guan)、低溫(wen)水(shui)浴(yu)鍋(guo)。

五(wu)、 連接反(fan)應　　　

          質粒酶切產(chan)物(wu)    1

          PCR酶切產(chan)物(wu)    4

          T₄ ligase         1

          10×bf           1

          H₂O            3

         -------------------------------

Total          10 μL

六、註(zhu)意事項(xiang)

1. 操作時(shi)，註(zhu)意保持低溫(wen)狀(zhuang)態，因為Ligase酶很容(rong)易降(jiang)解(jie)。

2. 連接反(fan)應，壹(yi)般14-16℃，O/N. 

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