分(fen)子(zi)生(sheng)物(wu)學(xue)實(shi)驗-載(zai)體和(he)目(mu)的片段(duan)的酶切

實(shi)驗三、載(zai)體和(he)目(mu)的片段(duan)的酶切

A 載(zai)體和(he)外源DNA的酶切

壹(yi)、實(shi)驗目(mu)的

學(xue)習(xi)和(he)掌(zhang)握(wo)核酸的酶切操(cao)作(zuo)原(yuan)理；通(tong)過(guo)酶切獲(huo)得可(ke)進(jin)行(xing)體(ti)外重組(zu)的載(zai)體和(he)外源DNA。

二(er)、實(shi)驗原(yuan)理

限制性內切酶能(neng)特(te)異地結(jie)合於(yu)壹(yi)段(duan)被稱(cheng)為(wei)限制性酶識(shi)別(bie)序(xu)列的DNA序(xu)列之(zhi)內或(huo)其附(fu)近的特(te)異位點上(shang)，並切割(ge)雙鏈DNA。絕(jue)大多(duo)數(shu)限制酶識(shi)別(bie)長(chang)度為(wei)4至6個核苷酸的回文(wen)對(dui)稱(cheng)特(te)異核苷酸序(xu)列(如EcoRⅠ識別(bie)六(liu)個核苷酸序(xu)列：5'- G↓AATTC-3')，有少(shao)數(shu)酶識(shi)別(bie)更(geng)長的序(xu)列或(huo)簡並序(xu)列。Ⅱ類酶切割(ge)位點在(zai)識(shi)別(bie)序(xu)列中，有的在(zai)對(dui)稱(cheng)軸(zhou)處切割(ge)，產生(sheng)平(ping)末(mo)端的DNA片段(duan)(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3')；有的切割(ge)位點在(zai)對(dui)稱(cheng)軸(zhou)壹(yi)側，產生(sheng)帶有單(dan)鏈(lian)突(tu)出(chu)末(mo)端的DNA片段(duan)稱(cheng)粘性未(wei)端(duan)，如(ru)EcoRⅠ切割(ge)識(shi)別(bie)序(xu)列5'…G↓AATTC…3' 後(hou)產生(sheng)兩(liang)個互(hu)補的粘性末(mo)端。

限制性內切酶的酶解(jie)反(fan)應(ying)最(zui)適(shi)條(tiao)件各(ge)不(bu)相同(tong)，各(ge)種酶有(you)其(qi)相應(ying)的酶切緩(huan)沖液和(he)最(zui)適(shi)反(fan)應(ying)溫(wen)度(大多(duo)數(shu)為(wei)37℃)。對(dui)質(zhi)粒(li)DNA酶切反(fan)應(ying)而言(yan)， 限制性內切酶用(yong)量可(ke)按(an)標(biao)準(zhun)體(ti)系(xi)1μg DNA加1單(dan)位酶，消(xiao)化(hua)1-2小時(shi)。但要(yao)全(quan)酶解(jie)則(ze)必須增加(jia)酶的用量，壹(yi)般(ban)增加(jia)2-3倍，甚(shen)至更多(duo)，反(fan)應(ying)時(shi)間(jian)也(ye)要(yao)適(shi)當(dang)延(yan)長。

酶活(huo)力(li)通常用(yong)酶單(dan)位（U）表示，酶單(dan)位的定義(yi)是：在(zai)最(zui)適(shi)反(fan)應(ying)條(tiao)件下(xia)，1小時(shi)全(quan)降(jiang)解(jie)1mg λDNA的酶量為(wei)壹(yi)個(ge)單(dan)位，但是(shi)許(xu)多(duo)實(shi)驗制備的DNA不(bu)象λDNA那樣易於(yu)降(jiang)解(jie)，需適當(dang)增加(jia)酶的使用(yong)量。反(fan)應(ying)液中加入(ru)過(guo)量的酶是(shi)不(bu)合(he)適(shi)的，除(chu)考慮(lv)成本(ben)外，酶液中的微量雜質(zhi)可(ke)能(neng)幹(gan)擾隨後(hou)的反(fan)應(ying)。         

三、主(zhu)要(yao)試(shi)劑(ji)

質(zhi)粒(li)pET30a、EcoRⅠ、HindⅢ、DNA產物(wu)純(chun)化(hua)kit、無菌水、乙醇、瓊脂(zhi)糖(tang)、溴酚(fen)藍、TAE、EB、DNA marker、NaAc

四(si)、儀器(qi)耗材(cai)

水浴鍋(guo)、滅(mie)菌鍋(guo)、離(li)心機、電泳儀、電泳槽、凝(ning)膠成像(xiang)儀、移液槍壹(yi)套(tao)、微波爐。

五(wu)、酶切反(fan)應(ying)  

反(fan)應(ying)體(ti)系(xi) 1.     質(zhi)粒(li)        3      

                    bf          2

                    EcoRⅠ      1      (10U/μL)

                    Hind Ⅲ     1      (10U/μL)

                    H₂O        13

               ---------------------------------------

                    Total       20 μL

     反(fan)應(ying)體(ti)系(xi) 2.    PCR產物(wu)   10     (50ng/μL)    （回收後(hou)的PCR產物(wu)）

                    bf          5

                    EcoRⅠ      1     (10U/μL)

                    Hind Ⅲ     1     (10U/μL)

                    H₂O        33

               ----------------------------------------

                   Total       50 μL

37℃，2-4hr； 65℃，10min，終止(zhi)反(fan)應(ying)。

質(zhi)粒(li)載(zai)體酶解(jie)液，瓊脂(zhi)糖(tang)膠電泳檢(jian)測(ce)。切膠(jiao)回收。

PCR產物(wu)酶切後(hou)不(bu)用(yong)回收，直接(jie)用於(yu)連(lian)接(jie)。可以電(dian)泳檢(jian)測(ce)回收效果。

六、註(zhu)意事(shi)項(xiang)

1、 DNA純度、緩(huan)沖液、溫度條(tiao)件及限制性內切酶本(ben)身都會影(ying)響限制性內切酶的活性(xing)。大部(bu)分(fen)限制性內切酶不(bu)受(shou)RNA或(huo)單(dan)鏈(lian)DNA的影響(xiang)。當(dang)微量的汙(wu)染(ran)物(wu)進(jin)入限制性內切酶貯(zhu)存(cun)液中時(shi)，會影(ying)響其進(jin)壹(yi)步使(shi)用(yong)，因此在(zai)吸(xi)取限制性內切酶時(shi)，每(mei)次(ci)都要(yao)用(yong)新(xin)的吸(xi)管頭(tou)。

2、 限制性內切酶壹(yi)旦(dan)拿(na)出(chu)冰箱後(hou)應(ying)當(dang)立即(ji)置(zhi)於(yu)冰(bing)上。酶應(ying)當(dang)是最(zui)後(hou)壹(yi)個(ge)被(bei)加(jia)入(ru)到反(fan)應(ying)體(ti)系(xi)中（在(zai)加(jia)入(ru)酶之(zhi)前所(suo)有的其它(ta)反(fan)應(ying)物(wu)都應(ying)當(dang)已(yi)經加好(hao)並(bing)已(yi)預(yu)混(hun)合）。

3、 10×bf工作(zuo)濃(nong)度為(wei)1×，註(zhu)意混(hun)勻。

4、 酶切時(shi)所(suo)加(jia)的DNA溶(rong)液體積不(bu)能(neng)太(tai)大，否則(ze)DNA溶(rong)液中其他(ta)成分(fen)會幹(gan)擾酶反(fan)應(ying)。

5、 酶通(tong)常保(bao)存(cun)在(zai)50%的甘(gan)油中，實(shi)驗中，應將(jiang)反(fan)應(ying)液中甘(gan)油濃(nong)度控制在(zai)1/10之下(xia)，否(fou)則(ze)，酶活(huo)性(xing)將(jiang)受(shou)影(ying)響。

6、 如果反(fan)應(ying)較(jiao)長(chang)時(shi)間(jian)而酶切體(ti)系(xi)又很(hen)小比如(ru)10微升，那麽哪(na)怕(pa)用PCR小管做(zuo)反(fan)應(ying)，體(ti)積損(sun)失(shi)也會很(hen)大。采用石蠟油覆(fu)蓋(gai)的方(fang)法可(ke)避免水分損(sun)失(shi)甘(gan)油濃(nong)度提(ti)高(gao)而引(yin)起(qi)的星活(huo)性。& O; c$ }  H8

7、 混合：這(zhe)是(shi)非(fei)常重(zhong)要(yao)然(ran)而常常被(bei)忽略的壹(yi)步。想(xiang)要(yao)反(fan)應(ying)完(wan)，必(bi)須使反(fan)應(ying)液充分(fen)混合(he)。我(wo)們(men)推(tui)薦(jian)用(yong)槍(qiang)反(fan)復吸(xi)取混合，或(huo)是用手指輕彈管(guan)壁(bi)混(hun)合(he)，然(ran)後(hou)再(zai)快速(su)離(li)心壹(yi)下(xia)即(ji)可(ke)。

註(zhu)意：不(bu)可(ke)振(zhen)蕩。

蘇州阿爾(er)法生(sheng)物(wu)十(shi)五(wu)年(nian)來(lai)壹(yi)直致(zhi)力(li)於(yu)銷(xiao)售(shou)各(ge)類實(shi)驗室儀器(qi)、實(shi)驗室設備、細(xi)胞培養(yang)耗材(cai)、試(shi)劑(ji)、高品(pin)質(zhi)進(jin)口移液器(qi)及其(qi)相關(guan)耗材(cai)。比如(ru)在(zai)移液槍領(ling)域(yu)，我們(men)作(zuo)為(wei)梅特(te)勒瑞寧移液器(qi)的授(shou)權(quan)代理商(shang)，可以提(ti)供(gong)單(dan)道(dao)移液器(qi)、8道移液器(qi)、12道移液器(qi)、間距(ju)可(ke)調(tiao)移液器(qi)、電動移液器(qi)、微量移液器(qi)、移液工作(zuo)臺(tai)等(deng)各(ge)種型(xing)號(hao)，以及移液過(guo)程中移液槍配(pei)套(tao)的LTS盒(he)裝吸(xi)頭(tou)、袋裝吸(xi)頭(tou)、進(jin)口吸(xi)頭(tou)等(deng)耗(hao)材(cai)，滿(man)足客戶在(zai)科(ke)研(yan)、醫(yi)學(xue)、制藥(yao)等(deng)領(ling)域(yu)的移液需求。另(ling)外還提(ti)供(gong)提(ti)供(gong)500多(duo)種(zhong)腫(zhong)瘤(liu)細(xi)胞，200多(duo)種(zhong)基(ji)因(yin)編(bian)輯(ji)細(xi)胞及細(xi)胞培養(yang)試劑(ji)、細(xi)胞培養(yang)耗材(cai)、細(xi)胞培養(yang)搖(yao)床、生(sheng)物(wu)反(fan)應(ying)器(qi)、實(shi)驗室儀器(qi)、實(shi)驗室設備、實(shi)驗室消(xiao)毒劑(ji)等(deng)。更(geng)多(duo)產品(pin)內容(rong)進(jin)入蘇州阿爾(er)法生(sheng)物(wu)實(shi)驗器(qi)材(cai)有(you)限公司 進(jin)行(xing)了(le)解。