組(zu)氨酸(suan)標(biao)簽(qian)蛋(dan)白(bai)親和純化介(jie)質過(guo)濾層析法(fa) Ni IDA Beads填料(liao)可以(yi)用於(yu)各(ge)種(zhong)表達(da)來(lai)源(yuan)（如(ru)大(da)腸(chang)桿菌、酵母、昆(kun)蟲(chong)細(xi)胞和哺(bu)乳(ru)動(dong)物細(xi)胞(bao)）的組(zu)氨酸(suan)標(biao)簽(qian)（6xHis-tagged）蛋(dan)白(bai)的純(chun)化。

組(zu)氨酸(suan)標(biao)簽(qian)蛋(dan)白(bai)親和純化介(jie)質過(guo)濾層析法(fa) Ni IDA Beads填料(liao)

      Ni IDA Beads可以(yi)用於(yu)各(ge)種(zhong)表達(da)來(lai)源(yuan)（如(ru)大(da)腸(chang)桿菌、酵母、昆(kun)蟲(chong)細(xi)胞和哺(bu)乳(ru)動(dong)物細(xi)胞(bao)）的組(zu)氨酸(suan)標(biao)簽(qian)（6xHis-tagged）蛋(dan)白(bai)的純(chun)化。它是以(yi)4%瓊(qiong)脂糖凝膠為(wei)基(ji)質(zhi)，通(tong)過化學方(fang)法(fa)偶聯(lian)了(le)三(san)配(pei)位(wei)的(de)亞氨基二乙(yi)酸（IDA），螯合(he)鎳(nie)離子（Ni2+）後(hou)，可以(yi)形成(cheng)比(bi)較(jiao)穩(wen)定的平面四(si)邊形結(jie)構，從(cong)而(er)有更(geng)多的(de)位點與(yu)組(zu)氨酸(suan)標(biao)簽(qian)上(shang)的咪唑環(huan)繼續配(pei)位(wei)，達(da)到(dao)結(jie)合(he)目的蛋(dan)白(bai)的效果(guo)。但(dan)是(shi)，這樣(yang)的(de)結(jie)構比(bi)較(jiao)容(rong)易受(shou)到(dao)其(qi)他小分(fen)子的進(jin)攻，鎳(nie)離子易被還(hai)原或(huo)者被螯合(he)，從(cong)而(er)破(po)壞(huai)其(qi)化學(xue)結(jie)構，無法(fa)結(jie)合(he)目的蛋(dan)白(bai)。Ni IDA Beads具(ju)有載量高，性能(neng)和價值(zhi)匹(pi)配(pei)等優(you)點。

表1. Ni IDA Beads產(chan)品(pin)性能(neng)

2.純(chun)化(hua)流(liu)程

2.1 緩沖液(ye)的(de)準(zhun)備

可使(shi)用下列推薦緩沖液(ye)，也(ye)可根(gen)據(ju)自(zi)己的使用習慣(guan)配(pei)置不同的緩沖液(ye)體(ti)系(xi)，基(ji)本(ben)原(yuan)理就是低咪唑上(shang)樣(yang)，高咪唑洗脫。緩沖液(ye)在使用前盡(jin)量(liang)用0.22 μm 或(huo)者0.45 μm 濾膜過(guo)濾除菌。具(ju)體(ti)配(pei)置方(fang)法(fa)見(jian)表2。

組(zu)氨酸(suan)標(biao)簽(qian)蛋(dan)白(bai)親和純化介(jie)質過(guo)濾層析法(fa) Ni IDA Beads填料(liao)純化蛋(dan)白(bai)流(liu)程：

2.2.1 細(xi)菌(jun)或(huo)酵母表達(da)的蛋(dan)白(bai)

1）挑(tiao)取單菌落(luo)到(dao)培(pei)養基中(zhong)，根(gen)據(ju)載體(ti)使(shi)用說明(ming)，加入相(xiang)應(ying)濃度的(de)誘(you)導劑誘(you)導相(xiang)應(ying)的(de)時(shi)間。

2）表達(da)結(jie)束(shu)後(hou)，將培(pei)養液(ye)轉(zhuan)移(yi)到(dao)離心(xin)杯(bei)中(zhong)，7，000 rpm（7，500×g），離心(xin)15min 收集菌(jun)體(ti)，然(ran)後(hou)按照(zhao)菌體(ti)∶Lysis Buffer=1∶10（WNV）加入

Lysis Buffer，加入終(zhong)濃度為(wei) 1mM的(de) PMSF。加入溶菌(jun)酶(mei)（工作濃度為(wei) 0.2-0.4 mg/ml，如(ru)果(guo)表達(da)的宿主細胞內(nei)含(han) pLysS 或(huo) pLysE，可以(yi)不加溶菌酶(mei)），同時(shi)也(ye)可加入其(qi)他蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑制(zhi)劑(ji)，但(dan)不能(neng)影響(xiang)目的蛋(dan)白(bai)與(yu)樹脂的結(jie)合(he)）。

3）將(jiang)菌體(ti)沈(chen)澱懸(xuan)浮起(qi)來(lai)，（如(ru)果(guo)菌(jun)液(ye)濃度高，也(ye)可考(kao)慮加入10 ug/ml RNase A和5 μg/ml DNase I），混勻，放置於(yu)冰上(shang)，然(ran)後(hou)冰上(shang)超(chao)聲破(po)碎(sui)細胞(bao)，至(zhi)菌液(ye)基(ji)本(ben)保(bao)持(chi)澄清(qing)。

4）將澄(cheng)清(qing)的破(po)碎(sui)液(ye)轉(zhuan)移(yi)至(zhi)離心(xin)管中(zhong)，10，000 rpm（15，000×g），4℃離心(xin) 20-30 min。取上(shang)清(qing)，置於(yu)冰上(shang)備(bei)用或(huo)-20℃保(bao)存。

2.2.2 酵母、昆(kun)蟲(chong)和哺(bu)乳(ru)細(xi)胞(bao)分泌表達(da)可溶(rong)性蛋(dan)白(bai)

1）將細(xi)胞培(pei)養液(ye)轉(zhuan)移(yi)至(zhi)離心(xin)杯(bei)，5.000 rpm（3.800×g）;離心(xin)10min，收集菌(jun)體(ti)得(de)上清(qing)，如上(shang)清(qing)中(zhong)不含(han) EDTA、組(zu)氨酸(suan)和還原劑等物質(zhi)，即可直(zhi)接(jie)加入柱子使用;如含(han)有(you) EDTA、組(zu)氨酸(suan)和還原劑等物質(zhi)，需(xu)用Lysis Buffer 透(tou)析才能(neng)加入柱子。2）對於(yu)大(da)量體(ti)積的(de)上(shang)清(qing)，需加入硫(liu)酸(suan)銨(an)沈(chen)澱濃縮後(hou)，蛋(dan)白(bai)還需(xu)用 Lysis Buffer 透(tou)析後(hou)才能(neng)加入柱子。

2.3 Ni IDA Beads 重力(li)柱的裝填

1）取合(he)適(shi)規(gui)格(ge)的(de)重力(li)層(ceng)析柱，裝入下墊片(pian)，加入適(shi)量純(chun)水潤洗柱管和墊片(pian)，關(guan)閉下出口(kou)。

2）將 Ni IDA Beads 混合(he)均(jun)勻，用槍頭(tou)吸(xi)取適(shi)量漿液(ye)加入至(zhi)重力(li)柱中(zhong)（介(jie)質實(shi)際體(ti)積占(zhan)懸(xuan)液(ye)的(de)壹半），打開下出口(kou)流(liu)幹保(bao)護液(ye)。

3）加入適(shi)量純(chun)水沖洗介(jie)質，待(dai)柱管中(zhong)液(ye)體(ti)重力(li)流(liu)幹後(hou)，關(guan)閉下出口(kou)。

4）裝入潤洗後(hou)的上(shang)墊(dian)片(pian)，確保(bao)墊片(pian)與(yu)填料(liao)之前沒有(you)空隙(xi)，且(qie)保(bao)持(chi)水平(ping)。

5）裝填(tian)好的重力(li)柱可以(yi)直接(jie)加入平衡液(ye)進(jin)行(xing)平(ping)衡，暫不使(shi)用時(shi)則加入保(bao)護液(ye)，4-30℃保(bao)存。

     蘇(su)州阿爾法(fa)生物提供的(de)瓊(qiong)脂糖凝膠介(jie)質、葡(pu)聚(ju)糖(tang)凝膠介(jie)質等蛋(dan)白(bai)純化(hua)和分離填料(liao)以(yi)及相(xiang)關(guan)生物試(shi)劑(ji)。另外還提供、氨(an)酸(suan)標(biao)簽(qian)蛋(dan)白(bai)親和純化介(jie)質、GST-tag蛋(dan)白(bai)親和純化介(jie)質、 MBP-tag蛋(dan)白(bai)親和純化介(jie)質、Biotin-tag蛋(dan)白(bai)親和純化介(jie)質、Strep-tagll標(biao)簽(qian)親(qin)和純化介(jie)質、 標(biao)簽(qian)抗(kang)體(ti)親(qin)和純化介(jie)質等標(biao)簽(qian)蛋(dan)白(bai)親和層析介(jie)質； 離子交(jiao)換層(ceng)析 、色譜(pu)柱、離子交(jiao)換層(ceng)析樹脂、疏水層析介(jie)質、 磁(ci)性微(wei)球(qiu)等。