類(lei)器(qi)官(guan)傳代關鍵步(bu)驟：操(cao)作(zuo)標(biao)準化、自(zi)身(shen)因(yin)素與(yu)營(ying)養(yang)優(you)化指南

  在類(lei)器(qi)官(guan)培(pei)養(yang)過程(cheng)中(zhong)，傳代是(shi)維(wei)持其(qi)長期穩(wen)定(ding)擴(kuo)增與(yu)功(gong)能(neng)活性(xing)的核心環節，而傳代效(xiao)率的高低直接取決於關鍵步(bu)驟的精準把控。以下(xia)將從操(cao)作(zuo)手法標(biao)準化、類器官(guan)自(zi)身(shen)因(yin)素影(ying)響(xiang)、營(ying)養(yang)體(ti)系(xi)優(you)化三大(da)維(wei)度(du)，詳細(xi)拆(chai)解類(lei)器官(guan)傳代的關鍵技(ji)術要(yao)點，為(wei)科研人員(yuan)提(ti)供可(ke)落(luo)地的實踐指(zhi)南。

壹、操(cao)作(zuo)手法標(biao)準化：以 “流程(cheng)優(you)化 - 參(can)數(shu)量化(hua) - 問題(ti)解(jie)決" 為(wei)核心

類(lei)器(qi)官(guan)傳代的操(cao)作(zuo)手法標(biao)準化是(shi)降低批(pi)次(ci)差(cha)異、提(ti)升可(ke)重(zhong)復性的關鍵，需圍繞(rao)基(ji)質(zhi)膠冷化(hua)、離心條(tiao)件(jian)、消化控制(zhi)、吹打技(ji)巧及分層(ceng)問題(ti)處(chu)理(li)五大(da)環節，建(jian)立(li)精準的參(can)數(shu)體(ti)系(xi)與(yu)動態決(jue)策方(fang)案。

1. 基質(zhi)膠冷化(hua)：按(an)敏(min)感性(xing)匹(pi)配溫(wen)度(du) - 時長組(zu)合

基質(zhi)膠的冷化(hua)處(chu)理(li)需根據類(lei)器(qi)官(guan)對溫(wen)度(du)和時長的敏感(gan)性差(cha)異調(tiao)整策略(lve)，避(bi)免(mian)因冷化(hua)不當(dang)影(ying)響(xiang)後(hou)續分(fen)離效(xiao)率與(yu)細(xi)胞(bao)活性(xing)：

• 溫(wen)度(du)敏感(gan)型類器官(guan)（如(ru)部(bu)分(fen)神(shen)經類器(qi)官(guan)）：推(tui)薦 4℃或(huo) 0℃預冷 30 分(fen)鐘(zhong)，既能(neng)保(bao)證基質(zhi)膠充分軟(ruan)化，又(you)可(ke)避(bi)免(mian)低溫(wen)對細胞(bao)的損(sun)傷；

• 時長敏(min)感(gan)型(xing)類器官(guan)（如(ru)快(kuai)速(su)增殖(zhi)的腫瘤(liu)類器官(guan)）：建(jian)議(yi) - 20℃預冷 5 分(fen)鐘(zhong)，縮(suo)短操(cao)作(zuo)周(zhou)期以減少(shao)細(xi)胞(bao)暴(bao)露(lu)在不適(shi)環境(jing)中(zhong)的時間。

實驗表明，0℃預冷可(ke)作(zuo)為(wei) 4℃的替代(dai)方(fang)案，在(zai)維持類器(qi)官(guan)活性(xing)的同時，兼(jian)容(rong)部(bu)分(fen)對低溫(wen)耐受性(xing)略(lve)高(gao)的類型(xing)。需特別(bie)註(zhu)意(yi)，冷化(hua)過程(cheng)中(zhong)溫(wen)度(du)波動需控制(zhi)在 ±1℃範(fan)圍內，否(fou)則會影(ying)響(xiang)基質(zhi)膠的黏度(du)壹致(zhi)性(xing)，進而幹擾(rao)後(hou)續傳代操(cao)作(zuo)。

2. 離心條(tiao)件(jian)：低溫(wen)與(yu)水(shui)平角(jiao)離心協(xie)同(tong)提升效(xiao)果(guo)

離心環節的核心目標(biao)是(shi)實(shi)現基(ji)質(zhi)膠與(yu)類(lei)器(qi)官(guan)的分層(ceng)，同時保(bao)留細胞(bao)活性(xing)，關鍵參(can)數(shu)與(yu)設(she)備(bei)選擇(ze)如(ru)下(xia)：

• 核心參(can)數(shu)：4℃低溫(wen)環境(jing)、200-300g 轉速、5 分鐘以內離心時長；

• 離心機(ji)選擇(ze)：優(you)先使用水(shui)平角(jiao)離心機(ji)，其(qi)在(zai)離心過程(cheng)中(zhong)可(ke)使樣(yang)本(ben)液柱(zhu)與(yu)離心管(guan)保(bao)持平行(xing)，讓(rang)基質(zhi)膠與(yu)類(lei)器(qi)官(guan)沈(chen)澱(dian)分(fen)層(ceng)更好，相比固(gu)定(ding)角(jiao)離心機(ji)，基質(zhi)膠殘留率可降低 25%，減少(shao)後(hou)續消(xiao)化步(bu)驟的幹擾(rao)；

• 類(lei)型(xing)適(shi)配調(tiao)整：體(ti)積較(jiao)大(da)的類器(qi)官(guan)（如(ru)肝(gan)類器(qi)官(guan)）建(jian)議(yi)采(cai)用 300g 離心 5 分(fen)鐘(zhong)，而鼠(shu)源(yuan)類(lei)器官(guan)可(ke)適(shi)當(dang)降低至 200g，避(bi)免(mian)因離心力(li)過大(da)造(zao)成機(ji)械(xie)損(sun)傷。

3. 消(xiao)化控(kong)制(zhi)：室溫(wen)鏡檢精準判斷終(zhong)點

消(xiao)化(hua)是(shi)解(jie)離類器官(guan)結(jie)構(gou)的關鍵步(bu)驟，需通(tong)過溫(wen)度(du)控制(zhi)與(yu)鏡(jing)檢觀察(cha)，平衡(heng)解(jie)離效(xiao)率與(yu)細(xi)胞(bao)活性(xing)：

• 操(cao)作(zuo)環境(jing)與(yu)時長：全(quan)程(cheng)在室(shi)溫(wen)超凈臺內進行，消(xiao)化(hua)時長嚴格(ge)控(kong)制(zhi)在 2-3 分鐘，避(bi)免(mian)高溫(wen)（如 37℃）導致(zhi)細(xi)胞(bao)雕(diao)亡(wang)率升高(gao)（室(shi)溫(wen)操(cao)作(zuo)可(ke)使(shi)雕(diao)亡(wang)率降低 15%），尤(you)其(qi)適(shi)用於胃腸(chang)道、食管等(deng)對酶(mei)解(jie)敏(min)感(gan)的類器(qi)官(guan)；

• 終(zhong)點判(pan)斷標(biao)準：通(tong)過顯(xian)微鏡觀(guan)察細(xi)胞(bao)團直徑，當(dang)細(xi)胞(bao)團達到 50-100μm 時，立(li)即(ji)終(zhong)止消(xiao)化(hua)；

• 酶(mei)試(shi)劑(ji)選擇(ze)：需匹(pi)配類(lei)器(qi)官(guan)組(zu)織(zhi)類(lei)型，例如肝(gan)類器(qi)官(guan)推(tui)薦使(shi)用 TrypLE™ Express 酶(mei)室(shi)溫(wen)孵育(yu) 5-10 分(fen)鐘(zhong)，腸(chang)類器官(guan)則(ze)優(you)先采(cai)用 Dispase 或(huo)專用消(xiao)化(hua)液 D，防止因(yin)過度(du)酶(mei)解(jie)導(dao)致(zhi)單細胞(bao)化，進而降低細胞(bao)活性(xing)。

4. 吹打技(ji)巧：低剪切(qie)力(li)實現高(gao)效(xiao)分(fen)散

吹打操(cao)作(zuo)的核心是(shi)在(zai)分散細胞(bao)團的同時，減少(shao)機(ji)械(xie)剪切(qie)力(li)對細胞(bao)的損(sun)傷，具(ju)體(ti)技(ji)巧如下(xia)：

• 工(gong)具(ju)選擇(ze)：采(cai)用 1mL 槍頭(tou)或(huo)無(wu)菌巴氏(shi)吸(xi)管(guan)，避(bi)免(mian)使用 200μL 槍頭(tou)（後(hou)者(zhe)易(yi)導(dao)致(zhi) 12% 的細胞(bao)碎(sui)裂(lie)率，而 1mL 槍頭(tou)可(ke)將碎(sui)裂(lie)率控制(zhi)在 5% 以下(xia)）；

• 操(cao)作(zuo)手法：以輕(qing)柔(rou)的圓(yuan)周運(yun)動吹打，吹打次數(shu)控制(zhi)在 30 次以內，全程(cheng)避(bi)免(mian)產生氣泡(pao)（氣(qi)泡(pao)會破(po)壞細(xi)胞(bao)結構(gou)）；

• 類型(xing)適配調(tiao)整：囊性類(lei)器(qi)官(guan)建(jian)議(yi)使用火(huo)焰(yan)拋光(guang)的玻(bo)璃巴氏(shi)吸(xi)管(guan)進行機(ji)械(xie)剪切(qie)，密集(ji)型類(lei)器官(guan)可(ke)結(jie)合 TrypLE Express 酶(mei)解(jie)後(hou)再(zai)行吹打，實現 “酶(mei)解(jie) + 機(ji)械(xie)分散(san)" 的協同(tong)優(you)化。

5. 問題(ti)解(jie)決：離心分(fen)層(ceng)的動態決(jue)策

離心後(hou)常見分層(ceng)結構(gou)為(wei) “緩沖液（上層(ceng)）- 基質(zhi)膠（中(zhong)層(ceng)）- 類器(qi)官(guan)沈(chen)澱(dian)（下(xia)層(ceng)）"，需根據類(lei)器(qi)官(guan)數(shu)量動態調(tiao)整保(bao)留策略(lve)，避(bi)免(mian)因處(chu)理(li)不當(dang)導(dao)致(zhi)細(xi)胞(bao)損(sun)失：

• 數(shu)量極少(shao)情況（如原(yuan)代培(pei)養(yang)或(huo)低代數(shu)傳代）：保(bao)留沈(chen)澱(dian)層(ceng) + 基質(zhi)膠下(xia) 2/3，點(dian)膠時新膠量(liang)需為殘留膠的 1.5 倍以上，彌補(bu)細胞(bao)數(shu)量不足的問題(ti)；

• 數(shu)量中(zhong)等(deng)情況：保(bao)留沈(chen)澱(dian)層(ceng) + 基質(zhi)膠全(quan)層(ceng)，同時增加離心轉速至 300g，減少(shao)基(ji)質(zhi)膠對後(hou)續培(pei)養(yang)的幹擾(rao)；

• 分(fen)層(ceng)模糊(hu)情況：加入(ru) 1mL 預(yu)冷緩沖液 G 重懸後(hou)，4℃靜置(zhi) 10 分鐘，利用密(mi)度(du)差(cha)異實(shi)現二(er)次(ci)分離，提升分(fen)層(ceng)清(qing)晰(xi)度(du)。

操(cao)作(zuo)要(yao)點(dian)速(su)覽(lan)

通(tong)過上述標(biao)準化操(cao)作(zuo)，可(ke)使(shi)類(lei)器官(guan)傳代效(xiao)率提升 30%，批(pi)次(ci)間變(bian)異系(xi)數(shu)從 22% 降至(zhi) 8%，為長期培養(yang)與(yu)藥物篩(shai)選提(ti)供穩(wen)定(ding)技(ji)術支(zhi)撐(cheng)。

二、類(lei)器(qi)官(guan)自(zi)身(shen)因(yin)素影(ying)響(xiang)：從活性(xing)、數(shu)量、結(jie)構(gou)把控(kong)傳代基(ji)礎(chu)

類(lei)器(qi)官(guan)自(zi)身(shen)的生物(wu)學(xue)特性(xing)是(shi)決(jue)定(ding)傳代效(xiao)率的內在因(yin)素，需從活性(xing)強度(du)、數(shu)量閾(yu)值、結構完(wan)整(zheng)性(xing)三個(ge)維(wei)度(du)進行評(ping)估與(yu)調(tiao)控，確保(bao)傳代過程(cheng)的可持續性(xing)。

1. 活性(xing)強度(du)：傳代能(neng)力(li)的核心決(jue)定(ding)因(yin)素

不同(tong)類型(xing)類器官(guan)的活性(xing)強度(du)差(cha)異顯(xian)著(zhu)，直接影(ying)響(xiang)其(qi)傳代潛(qian)力(li)，可根據(ju)傳代難度(du)分為(wei) “易傳代" 與(yu) “難傳代" 兩(liang)類(lei)：

• 易傳代類(lei)器(qi)官(guan)：以腸癌(ai)、子(zi)宮(gong)內膜癌(ai)類器(qi)官(guan)為(wei)代(dai)表，其(qi)幹性(xing)維(wei)持能(neng)力(li)強，連(lian)續(xu)傳代可(ke)達 30 代以上；鼻類器官(guan)更具特殊(shu)性(xing)，可通(tong)過自(zi)發(fa)支(zhi)持病(bing)毒(du)復制(zhi)實現無(wu)需外源(yuan)性(xing)因子(zi)的連續(xu)傳代；

• 難傳代類(lei)器(qi)官(guan)：包(bao)括肝(gan)癌(ai)、前列腺(xian)癌(ai)、甲狀(zhuang)腺癌(ai)類器(qi)官(guan)，傳代後(hou)常因幹性(xing)耗竭出現生(sheng)長停(ting)滯(zhi)甚(shen)至(zhi)雕(diao)亡(wang)；氣(qi)道類(lei)器官(guan)則(ze)需抑(yi)制(zhi)幹擾(rao)素通(tong)路（如使用 CYT387），才(cai)能(neng)克(ke)服免疫反(fan)應(ying)導(dao)致(zhi)的傳代障(zhang)礙(ai)。

類(lei)器官(guan)的活性(xing)強度(du)與(yu)幹細(xi)胞(bao)微環境(jing)信(xin)號(hao)密(mi)切(qie)相關，例如腦(nao)腫瘤(liu)幹細(xi)胞(bao)類器(qi)官(guan)需持續補(bu)充 Wnt3a 與(yu) RSPO1 信(xin)號(hao)分(fen)子(zi)，若(ruo)缺失此(ci)類(lei)幹性(xing)維(wei)持因子(zi)，傳代後(hou)細胞(bao)會迅速分化並喪(sang)失(shi)增殖(zhi)活性(xing)。

2. 數(shu)量閾(yu)值：密度(du)依賴性增殖(zhi)的臨(lin)界調(tiao)控

類器(qi)官(guan)傳代需滿足 “數(shu)量閾(yu)值"，即單位(wei)培(pei)養(yang)空(kong)間內達到足夠數(shu)量的功能(neng)性細(xi)胞(bao)團，以保(bao)障旁(pang)分泌信(xin)號(hao)網(wang)絡的完(wan)整(zheng)性(xing)，避(bi)免(mian)陷(xian)入(ru) “增殖(zhi)停(ting)滯(zhi)陷(xian)阱(jing)"：

• 臨(lin)界數(shu)量標(biao)準：24 孔(kong)板(ban)培(pei)養(yang)體(ti)系(xi)中(zhong)，每(mei)孔(kong)類(lei)器(qi)官(guan)數(shu)量需≥20 個；若(ruo)低於此(ci)閾(yu)值（如每(mei)孔(kong)僅(jin) 5-15 個(ge)），細(xi)胞(bao)團分泌的生長因(yin)子(zi)（如 EGF、FGF）濃(nong)度(du)不足，會導致(zhi)增殖(zhi)效(xiao)率大(da)幅(fu)下(xia)降；

• 密(mi)度(du)適配(pei)調(tiao)整：鋪板(ban)密(mi)度(du)需嚴格(ge)控(kong)制(zhi)，過高(gao)（>150 個(ge) / 孔(kong)）會導致(zhi)營(ying)養(yang)競(jing)爭加(jia)劇(ju)，培養(yang)基(ji) 24 小(xiao)時內即變(bian)黃(huang)，代(dai)謝(xie)廢(fei)物積累抑(yi)制(zhi)生長；過低（<20 個 / 孔(kong)）則(ze)因(yin)自(zi)分(fen)泌因子(zi)匱乏(fa)，類(lei)器官(guan)形(xing)成效(xiao)率降低 50% 以上；

• 收獲(huo)時機(ji)影(ying)響(xiang)：原代類器官(guan)的收獲(huo)時機(ji)直接影(ying)響(xiang)數(shu)量達標(biao)率，例如中(zhong) / 後(hou)腸球狀(zhuang)體(ti)需在分化(hua)第 5-9 天(tian)收(shou)集(ji)，過早（第 5 天(tian)）或(huo)過晚(wan)（>9 天(tian)）均(jun)會導致(zhi)細(xi)胞(bao)團活性(xing)下(xia)降，間接減少(shao)有(you)效(xiao)傳代數(shu)量。

3. 結(jie)構(gou)完(wan)整(zheng)性(xing)：形態(tai)學(xue)評(ping)估與(yu)傳代時機(ji)判斷

類(lei)器官(guan)的結構(gou)特征(zheng)是(shi)判(pan)斷傳代時機(ji)的直觀(guan)指標(biao)，需通(tong)過形(xing)態(tai)學(xue)觀(guan)察(cha)與(yu)定(ding)量(liang)測量聯(lian)合判斷，確保(bao)傳代時細(xi)胞(bao)處(chu)於最佳(jia)生(sheng)長狀(zhuang)態(tai)：

• 理(li)想(xiang)結(jie)構(gou)標(biao)準：

◦ 形態：呈規則(ze)囊狀（如(ru)腸(chang)道類(lei)器官(guan)）、多(duo)小(xiao)葉(ye)狀(zhuang)（如(ru)肝(gan)類器(qi)官(guan)）或(huo)分支(zhi)管(guan)狀（如肺(fei)類(lei)器官(guan)），無(wu)中(zhong)心暗(an)區(qu)及壞死竈(zao)；

◦ 直徑(jing)：人(ren)源(yuan)類(lei)器官(guan)通(tong)常為 200-500μm，鼠(shu)源(yuan)類(lei)器官(guan)較(jiao)小(xiao)（100-200μm），超過此(ci)範(fan)圍易(yi)出(chu)現中(zhong)心壞(huai)死；

◦ 生長狀(zhuang)態(tai)：每(mei)日直(zhi)徑(jing)增幅 5-10%，培(pei)養(yang)基(ji)清(qing)澈（未(wei)變(bian)黃(huang)），無(wu)局部(bu)細(xi)胞(bao)死亡跡象；

• 傳代時機(ji)觸發：當(dang)觀(guan)察到類(lei)器(qi)官(guan)生(sheng)長速(su)率減慢(man)（直徑(jing)每(mei)日增幅 < 5%）、培(pei)養(yang)基(ji) pH 下(xia)降（顏(yan)色變(bian)黃(huang)）或(huo)局部(bu)出(chu)現暗(an)腔(qiang)時，需立即啟(qi)動傳代；

• 碎(sui)片(pian)大(da)小(xiao)要求：機(ji)械(xie)破(po)碎(sui)後(hou)，需保(bao)留 > 100μm 的細胞(bao)團碎(sui)片(pian)，此(ci)類碎(sui)片(pian)的生長率顯(xian)著(zhu)高於單細胞(bao)或(huo)小碎(sui)片(pian)（<50μm），後(hou)者(zhe)的類器(qi)官(guan)形(xing)成率僅 10-15%；

• 類(lei)型適配調(tiao)整：不同(tong)類器(qi)官(guan)的結構(gou)判斷標(biao)準存在差(cha)異，例如食管類(lei)器(qi)官(guan)以 “角化(hua)珠(zhu)形成" 為傳代標(biao)誌(zhi)（培養(yang) 9-14 天(tian)），腦(nao)類器(qi)官(guan)則(ze)需結合神經球緊(jin)湊度(du)及神經元標(biao)誌(zhi)物（如 β-III tubulin）表達綜(zong)合判斷。

三(san)、營(ying)養(yang)體(ti)系(xi)優(you)化：為傳代提(ti)供精(jing)準 “能(neng)量供給(gei)"

類(lei)器(qi)官(guan)傳代效(xiao)率的穩(wen)定(ding)性(xing)高度(du)依賴營(ying)養(yang)體(ti)系(xi)的精準調(tiao)控，需從培養(yang)基(ji)管(guan)理(li)、消(xiao)化(hua)液(ye)適配、添(tian)加(jia)劑(ji)優(you)化三個(ge)維度(du)構建(jian)協(xie)同體(ti)系(xi)，平衡(heng)幹細(xi)胞(bao)幹性(xing)維(wei)持與(yu)定(ding)向(xiang)分化(hua)需求。

1. 培(pei)養(yang)基(ji)管(guan)理(li)：儲存策略(lve)與(yu)配(pei)方(fang)適配(pei)

培養(yang)基(ji)是(shi)類(lei)器官(guan)傳代的 “能(neng)量核心"，其(qi)質(zhi)量控(kong)制(zhi)需關註(zhu)因(yin)子(zi)活性(xing)維(wei)持與(yu)個(ge)性(xing)化配方(fang)選擇(ze)：

• 儲存策略(lve)：

◦ 培(pei)養(yang)基(ji)（含生(sheng)長因(yin)子(zi)）需 - 20℃分裝(zhuang)儲存，有效(xiao)期可延(yan)長至(zhi) 1 年(nian)；

◦ 4℃短期儲存需嚴格(ge)控(kong)制(zhi)在 2 周內，超過 1 個(ge)月(yue)會導致(zhi)關鍵因(yin)子(zi)（如 Wnt3a、R-spondin-1）活性(xing)顯(xian)著(zhu)下(xia)降，使(shi)類器官(guan)增殖(zhi)率從 90% 降至(zhi) 55%；

◦ 傳代後(hou)幹細(xi)胞(bao)對培養(yang)基(ji)質(zhi)量更敏感，需絕(jue)對避(bi)免(mian)使用儲存過久的培養(yang)基(ji)；

• 配(pei)方(fang)適配(pei)：

◦ 腸道類(lei)器官(guan)：人(ren)源(yuan)推(tui)薦使(shi)用 IntestiCult™ Organoid Growth Medium (human)，鼠(shu)源(yuan)使(shi)用對應小鼠(shu)版(ban)本(ben)，此類(lei)培養(yang)基(ji)通(tong)過預(yu)優(you)化 Wnt/R-spondin 信(xin)號(hao)軸(zhou)濃(nong)度(du)，可提(ti)升傳代後(hou) 24 小時貼壁(bi)率；

◦ 乳(ru)腺(xian)類器官(guan)：可(ke)測(ce)試(shi) 1 型和 2 型擴(kuo)增培養(yang)基(ji)，或(huo)采(cai)用自(zi)制(zhi)條件(jian)培養(yang)基(ji)（含 R-spondin-1、Noggin 和 Wnt3a）；

◦ 腦(nao)腫瘤(liu)幹細(xi)胞(bao)類器(qi)官(guan)：需使用 10-DPM 培(pei)養(yang)基(ji)，其(qi)中(zhong) 4-DPM（RG108、A83-01、毛(mao)喉素、Bay K8644）為必(bi)需小分子(zi)，添加(jia) RSPO1 的 5-DPM 配方(fang)可實(shi)現長期傳代；

• 操(cao)作(zuo)規範(fan)：

◦ 商品(pin)化培(pei)養(yang)基(ji)（如(ru) IntestiCult™）37℃水(shui)浴解(jie)凍(dong)後(hou)應立(li)即使用，禁(jin)止(zhi)再(zai)次冷凍(dong)；

◦ 基(ji)質(zhi)膠使(shi)用濃(nong)度(du)需 > 70%，操(cao)作(zuo)全(quan)程(cheng)在冰(bing)上進行以防提前凝(ning)固(gu)；

◦ 換(huan)液(ye)頻率建(jian)議(yi)每(mei) 3-5 天(tian)壹次，維(wei)持穩(wen)定(ding)的營(ying)養(yang)微環境(jing)。

2. 消(xiao)化液適配(pei)：酶(mei)組(zu)合與(yu)活性(xing)維(wei)持

消化(hua)液(ye)的選擇(ze)與(yu)管(guan)理(li)直(zhi)接影(ying)響(xiang)類器官(guan)解(jie)離效(xiao)率與(yu)細(xi)胞(bao)存活率，需根據組(zu)織(zhi)類型匹(pi)配酶(mei)組(zu)合，並嚴格(ge)控(kong)制(zhi)酶(mei)活性(xing)：

• 酶(mei)組(zu)合選擇(ze)：

◦ 腸(chang)道類(lei)器官(guan)：推(tui)薦使(shi)用 TrypLE™ Express，其(qi)溫(wen)和的蛋白水(shui)解(jie)活性(xing)可(ke)減少(shao)幹細(xi)胞(bao)損(sun)傷；

◦ 胰腺(xian)類器官(guan)：需 Dispase 與(yu) DNAse I 聯(lian)用，Dispase 分(fen)解(jie)細胞(bao)外基(ji)質(zhi)的同時，DNAse I 可(ke)降解(jie)遊離 DNA，防止細(xi)胞(bao)團聚；

◦ 專用消(xiao)化(hua)液優(you)勢：針(zhen)對性酶(mei)組(zu)合可使傳代後(hou)細胞(bao)存活率提升 20%，優(you)於通(tong)用消(xiao)化(hua)液；

• 儲存與(yu)使(shi)用：

◦ 消(xiao)化(hua)液需 - 20℃分裝(zhuang)保(bao)存以維持酶(mei)活，有(you)效(xiao)期可達 1 年；

◦ 4℃儲存建(jian)議(yi) 2 周內用完(wan)，超(chao)過 1 個(ge)月(yue)會出現酶(mei)活性(xing)下(xia)降，增加過度(du)消化(hua)風(feng)險(xian)；

◦ 腸道隱窩(wo)來源(yuan)類(lei)器官(guan)消(xiao)化(hua)後(hou)接種(zhong)時，需添加抗(kang)生(sheng)素（如慶大(da)黴素終(zhong)濃(nong)度(du) 50µg/ml）抑(yi)制(zhi)共生微生物(wu)汙(wu)染，抗生素應在(zai)使用前新鮮添加(jia)。

3. 添加(jia)劑(ji)優(you)化：難養(yang)類(lei)器(qi)官(guan)的存活調(tiao)控

針(zhen)對肝(gan)、食管等(deng)難養(yang)類(lei)器(qi)官(guan)，需通(tong)過精(jing)準添加信(xin)號(hao)通(tong)路調(tiao)節劑與(yu)生(sheng)長因(yin)子(zi)，提升傳代效(xiao)率與(yu)細(xi)胞(bao)存活：

• 難養(yang)類(lei)器(qi)官(guan)適(shi)配(pei)添(tian)加劑：

◦ 肝(gan)類器(qi)官(guan)：推(tui)薦添(tian)加(jia) Oncostatin M（OSM，50ng/mL），通(tong)過激(ji)活 STAT3 通(tong)路促(cu)進肝(gan)細胞(bao)成熟與(yu)存活；或(huo)使用 Y-27632（10μM）抑(yi)制(zhi) ROCK 激酶(mei)活性(xing)，減少(shao)傳代過程(cheng)中(zhong)的雕(diao)亡(wang)；

◦ 食管類(lei)器(qi)官(guan)：Y-27632 需在接種(zhong)第 0 天(tian)添(tian)加(jia)，肝(gan)類器(qi)官(guan)可(ke)在(zai)整(zheng)個擴(kuo)增階(jie)段(duan)持續使(shi)用；

• 擴(kuo)張培(pei)養(yang)基(ji)因(yin)子(zi)組合：

◦ 核心成分：包(bao)含 EGF、HGF、FGF-10 等(deng)生(sheng)長因(yin)子(zi)，TGFβ 抑(yi)制(zhi)劑（A83-01、Noggin）及 PKA 激活劑(ji)（forskolin），兼(jian)顧增殖(zhi)與(yu)幹性(xing)維(wei)持；

• 階(jie)段(duan)性(xing)調(tiao)整：

◦ 傳代起始階(jie)段(duan)：采(cai)用低 FGF2 的起始培(pei)養(yang)基(ji)；

◦ 第 4 天(tian)：換(huan)用含 GlutaMaxx 和 FBS 的 IPS 培養(yang)基(ji)；

◦ 第 6 天(tian)起：切(qie)換(huan)為(wei) N2 神經誘導(dao)培養(yang)基(ji)，通(tong)過階(jie)段(duan)性(xing)營(ying)養(yang)調(tiao)控實現定(ding)向(xiang)分化(hua)；

• 試(shi)劑(ji)盒優(you)勢：部(bu)分(fen)專(zhuan)用試(shi)劑(ji)盒濟(ji)研通(tong)過優(you)化因子(zi)配比(bi)，可提(ti)升營(ying)養(yang)體(ti)系(xi)穩(wen)定(ding)性(xing)，降低批(pi)次(ci)間差(cha)異。