類器(qi)官(guan)傳代(dai)效率(lv)怎(zen)麽提(ti)升(sheng)？關(guan)鍵(jian)技(ji)術、研(yan)究進(jin)展(zhan)及優(you)化方(fang)法(fa)指南

在生物醫(yi)學(xue)研(yan)究領(ling)域(yu)，類器(qi)官(guan)正(zheng)憑(ping)借(jie)其(qi)優(you)勢改(gai)變著科(ke)研(yan)格(ge)局。作為(wei)由(you)幹細(xi)胞或多能(neng)幹(gan)細(xi)胞(bao)經(jing)三(san)維(wei)培(pei)養形成(cheng)的(de)微(wei)型(xing)組(zu)織(zhi)模型，類器(qi)官(guan)能高(gao)度模擬(ni)體(ti)內器(qi)官(guan)的結(jie)構(gou)與功能，在疾病(bing)建模、精(jing)準醫(yi)學(xue)、藥(yao)物篩(shai)選(xuan)及再生醫(yi)學(xue)等(deng)領(ling)域(yu)展現出巨(ju)大應(ying)用(yong)潛力(li)。比(bi)如肝(gan)細(xi)胞類器(qi)官(guan)為(wei)肝(gan)臟移植(zhi)提(ti)供(gong)了(le)新平臺，呼(hu)吸道(dao)類器(qi)官(guan)還(hai)成(cheng)功(gong)實現了(le)人鼻(bi)病(bing)毒 C 的(de)連(lian)續(xu)傳(chuan)代(dai)培(pei)養，解(jie)決了(le)傳統(tong)細(xi)胞(bao)系(xi)中(zhong)難(nan)以培(pei)養該(gai)病(bing)毒的(de)難題(ti)。

相較於傳(chuan)統(tong) 2D 細(xi)胞(bao)培(pei)養無法模擬(ni)組(zu)織(zhi)微(wei)環(huan)境(jing)、動(dong)物模型存(cun)在物種差(cha)異及倫(lun)理限(xian)制(zhi)的局限性(xing)，類器(qi)官(guan)在保留組(zu)織(zhi)異質性(xing)、維(wei)持(chi)基(ji)因組(zu)穩定(ding)性方(fang)面優(you)勢較(jiao)高，被視作替代(dai)傳(chuan)統(tong)模型的 “活(huo)體生(sheng)物庫(ku)"。但(dan)類器(qi)官(guan)技術(shu)的廣泛(fan)應(ying)用(yong)，卻受限於長期培(pei)養過程中(zhong)的(de)關(guan)鍵(jian)瓶頸 —— 傳(chuan)代(dai)操作。傳代(dai)是維(wei)持(chi)類器(qi)官(guan)持(chi)續擴(kuo)增與功能穩定(ding)的核(he)心環節，其(qi)效率(lv)直(zhi)接決定(ding)實驗的可(ke)重(zhong)復性(xing)與研(yan)究進(jin)展(zhan)。

當(dang)前，像(xiang)肝(gan)癌(ai)、甲狀(zhuang)腺癌這(zhe)類難養類器(qi)官(guan)，在傳代(dai)過(guo)程中(zhong)普遍(bian)面臨(lin)活(huo)性不足(zu)、結(jie)構(gou)破壞等問題(ti)，有(you)數(shu)據顯示(shi)肝(gan)癌(ai)類器(qi)官(guan)傳代(dai)後(hou)存(cun)活率(lv)不(bu)足(zu) 40%，導(dao)致這(zhe)類模型難以用於長期實驗研(yan)究。此外(wai)，傳代(dai)過(guo)程中(zhong)細(xi)胞(bao)存(cun)活率(lv)低(di)、增殖(zhi)效率(lv)差(cha)等問題(ti)，也制(zhi)約著胰腺癌(ai)等(deng)疾病模型的研(yan)究進(jin)程，優(you)化傳(chuan)代(dai)技(ji)術(shu)已(yi)迫(po)在眉睫(jie)。

傳(chuan)代(dai)技(ji)術(shu)的(de)核心挑戰主(zhu)要體(ti)現在三個方(fang)面：壹(yi)是機械(xie)或酶解(jie)分離容(rong)易(yi)破壞類器(qi)官(guan)結構(gou)完(wan)整性(xing)；二是消(xiao)化時間(jian)與力度控制(zhi)不當(dang)會(hui)導(dao)致細胞(bao)活性(xing)下降(jiang)；三是傳代(dai)後(hou)基(ji)質包(bao)埋與培(pei)養條(tiao)件(jian)適(shi)配(pei)性不(bu)足(zu)，影(ying)響(xiang)後(hou)續(xu)增殖(zhi)效率(lv)。這(zhe)些(xie)問題(ti)在幹細(xi)胞(bao)來源(yuan)的復(fu)雜(za)類器(qi)官(guan)（如肝(gan) / 胰腺共(gong)祖(zu)細(xi)胞(bao)衍(yan)生模型）中(zhong)更(geng)為(wei)突出，直(zhi)接(jie)限制(zhi)了(le)其(qi)從基(ji)礎研(yan)究向(xiang)臨(lin)床轉(zhuan)化(hua)的(de)應(ying)用。

基(ji)於此，深(shen)入分析類器(qi)官(guan)傳代(dai)的(de)關(guan)鍵(jian)技(ji)術節(jie)點(dian)，建立標(biao)準化(hua)操作流程，提(ti)供(gong)試(shi)劑(ji)盒選擇(ze)的科(ke)學(xue)依(yi)據，探(tan)討技(ji)術優(you)化路(lu)徑，對於(yu)解(jie)決難養類器(qi)官(guan)傳代(dai)困(kun)境、推(tui)動(dong)類器(qi)官(guan)技術(shu)在精(jing)準醫(yi)學(xue)與再生醫(yi)學(xue)領(ling)域(yu)的規範(fan)化應(ying)用具(ju)有(you)重(zhong)要意(yi)義。

壹(yi)、類器(qi)官(guan)傳代(dai)效率(lv)提(ti)升(sheng)關(guan)鍵(jian)技(ji)術點(dian)

想要提(ti)升(sheng)類器(qi)官(guan)傳代(dai)效率(lv)，需(xu)精(jing)準把控消(xiao)化、離心、基(ji)質膠處理等(deng)關(guan)鍵(jian)環(huan)節，具(ju)體技(ji)術(shu)要(yao)點(dian)如下：

• 消(xiao)化體(ti)系：采(cai)用(yong)機(ji)械(xie)分散(san)與酶解(jie)結合的方(fang)式(shi)，先(xian)通(tong)過(guo) 200μm 濾網過濾進(jin)行(xing)機(ji)械(xie)分散(san)，再用 0.25% Trypsin-EDTA 在 37℃條(tiao)件(jian)下孵(fu)育 5 分鐘，實現類器(qi)官(guan)的有(you)效分(fen)離。

• 離心條(tiao)件(jian)：使用(yong) 4℃預(yu)冷(leng)的(de)離心機，以 200×g 的轉(zhuan)速(su)離心 5 分鐘，離心完(wan)成(cheng)後(hou)棄去(qu)上(shang)清液，用(yong)培(pei)養基(ji)重(zhong)懸(xuan)沈(chen)澱，保留細胞(bao)活性(xing)。

• 基(ji)質膠處理：基(ji)質膠需(xu)在冰上(shang)融(rong)化，之後(hou)與細胞懸(xuan)液按 1:3 的(de)體(ti)積(ji)比(bi)混(hun)合，同時要(yao)確(que)保(bao)每(mei)孔(kong)接種密(mi)度達(da)到 5×10⁴個細胞(bao)，為(wei)類器(qi)官(guan)後(hou)續(xu)生長提供(gong)良好(hao)基(ji)礎。

二、類器(qi)官(guan)傳代(dai)技(ji)術(shu)的(de)研(yan)究進(jin)展(zhan)

類器(qi)官(guan)傳代(dai)技(ji)術(shu)的(de)發展(zhan)，見(jian)證了(le) 3D 細胞(bao)培(pei)養從依(yi)賴(lai)經(jing)驗(yan)到標(biao)準化(hua)、精(jing)準化(hua)的轉(zhuan)變。早期傳(chuan)代(dai)操作高度依(yi)賴(lai)研(yan)究者(zhe)經(jing)驗(yan)，比(bi)如用(yong)手動(dong)刮除(chu)基(ji)質膠的(de)物理(li)分(fen)離方(fang)式(shi)，容(rong)易(yi)造(zao)成(cheng)細(xi)胞(bao)機(ji)械(xie)損傷；酶消(xiao)化時間(jian)僅靠肉眼(yan)判斷，主觀性強(qiang)，常出現消(xiao)化過(guo)度或不充分(fen)的情況，直(zhi)接影(ying)響(xiang)細(xi)胞(bao)存(cun)活率(lv)與類器(qi)官(guan)結構(gou)完(wan)整性(xing)。這(zhe)種粗(cu)放(fang)式操作導(dao)致不同實驗室(shi)、甚至(zhi)同壹(yi)實驗室(shi)不同批次的傳(chuan)代(dai)結(jie)果(guo)差(cha)異明(ming)顯，嚴重(zhong)制(zhi)約了(le)類器(qi)官(guan)技術(shu)的可(ke)重(zhong)復性(xing)與轉(zhuan)化(hua)進(jin)程。

（壹(yi)）技術突破：從流程優(you)化到體系創(chuang)新

近五年(nian)，類器(qi)官(guan)傳代(dai)技(ji)術(shu)在標(biao)準化(hua)與效率(lv)提(ti)升(sheng)方(fang)面取(qu)得(de)多項關(guan)鍵(jian)突破，形成(cheng)了(le)多維(wei)度(du)的(de)技術(shu)革(ge)新：

1. 標(biao)準化(hua)操作體系構(gou)建：消(xiao)化酶與傳代(dai)參(can)數的(de)優(you)化是流程標(biao)準化(hua)的核心。TrypLE™系列等(deng)胰蛋白酶替代(dai)產(chan)品(pin)，憑(ping)借(jie)更(geng)溫(wen)和的(de)酶解(jie)特性，大幅降(jiang)低了(le)傳統(tong)胰酶對細(xi)胞(bao)表面受體的破壞；傳代(dai)比(bi)例(li)控(kong)制(zhi)（1:2-1:4）與機械(xie)分散(san)技術(shu)結合，實現了(le)腸道(dao)、肝(gan)等(deng)常規類器(qi)官(guan)的穩定(ding)傳代(dai)。此外(wai)，食(shi)管類器(qi)官(guan)還(hai)建立起(qi)包含(han) Dispase 消(xiao)化、胰蛋白酶解(jie)離及(ji) 40μm 過(guo)濾器(qi)過(guo)濾的(de)三(san)步(bu)標(biao)準化(hua)流程，將(jiang)原(yuan)代(dai)組(zu)織(zhi)的傳(chuan)代(dai)成(cheng)功(gong)率(lv)提(ti)升(sheng)至(zhi) 85% 以上。

2. 無基(ji)質膠培(pei)養與水凝膠體(ti)系革(ge)新：同濟大學(xue)開(kai)發的(de) BEX 擴(kuo)增體(ti)系(xi)打(da)破了(le)傳統(tong)基(ji)質膠的(de)限制(zhi)，該(gai)體(ti)系通(tong)過 5-DPM 培(pei)養基(ji)（含 RG108、A83-01、毛喉素(su)等(deng)小(xiao)分子(zi)抑(yi)制(zhi)劑(ji)與 RSPO1 生長因子(zi)）與 HAHS 水凝膠的(de)組(zu)合，實現了(le)膽(dan)管類器(qi)官(guan)在 60 天內 3000 倍(bei)擴(kuo)增(zeng)，且(qie)可穩定(ding)傳代(dai) 20 代(dai)以上。通過成(cheng)分(fen)確(que)定(ding)的(de)化(hua)學(xue)微(wei)環(huan)境(jing)調(tiao)控，該(gai)體(ti)系避(bi)免了(le)基(ji)質膠批次差異帶(dai)來的(de)幹擾，為(wei)膽(dan)管疾(ji)病(bing)建模與藥物篩(shai)選(xuan)提供(gong)了(le)穩定(ding)的體(ti)外(wai)模型。

3. 功能(neng)維(wei)持(chi)與精(jing)準調(tiao)控技(ji)術(shu)：日(ri)本(ben)研(yan)究團(tuan)隊(dui)發現，OSM（Oncostatin M）可通(tong)過(guo)激(ji)活(huo) STAT3 通(tong)路(lu)，顯著提升(sheng)肝(gan)細(xi)胞類器(qi)官(guan)的代(dai)謝功能(neng)維(wei)持(chi)能力(li)，使傳代(dai)後(hou)細(xi)胞的(de)尿素合成(cheng)與藥物代(dai)謝活性(xing)保留率(lv)提(ti)高 40% 以上。在病毒(du)研(yan)究領(ling)域(yu)，呼(hu)吸道(dao)類器(qi)官(guan)通過(guo)引(yin)入 CYT387 抑(yi)制(zhi)幹擾素通(tong)路(lu)，實現人鼻(bi)病(bing)毒 C 在氣(qi)道(dao)上皮類器(qi)官(guan)中(zhong)的(de)連(lian)續(xu) 5 次傳代(dai)，而(er)鼻(bi)類器(qi)官(guan)更(geng)展(zhan)現出自發支持(chi)病毒(du)傳代(dai)的(de)優(you)勢，為(wei)呼(hu)吸道(dao)病毒致病機(ji)制(zhi)研(yan)究提(ti)供(gong)了(le)全新工(gong)具(ju)。

4. 自動(dong)化與專用試劑(ji)系統(tong)開(kai)發：針對傳(chuan)代(dai)痛(tong)點(dian)，相關(guan)廠(chang)商推(tui)出了(le)專用(yong)試(shi)劑(ji)盒，大幅降(jiang)低了(le)操作門(men)檻(kan)。例如含(han)鼠源(yuan)特異性生(sheng)長因子(zi)的培(pei)養基(ji)，可精(jing)準匹(pi)配(pei)腸道(dao)幹細胞(bao)的自我(wo)更(geng)新需求；生物相(xiang)容(rong)性水凝膠凍(dong)存(cun)試劑(ji)，能將(jiang)類器(qi)官(guan)凍(dong)存(cun)復蘇(su)後(hou)的(de)存(cun)活率(lv)提(ti)升(sheng)至(zhi) 90% 以上。最(zui)新研(yan)究顯示(shi)，通過(guo)分(fen)群(qun)結構(gou)分(fen)析(xi)、時序(xu)分群占(zhan)比(bi)密(mi)度矩(ju)陣(zhen)構(gou)建及生長函數(shu)修正(zheng)的(de)自動(dong)化傳(chuan)代(dai)控(kong)制(zhi)系統(tong)，可(ke)實現傳代(dai)時機(ji)的精(jing)準判(pan)斷，使(shi)培(pei)養效率(lv)提(ti)升(sheng) 35%。

（二）傳(chuan)代(dai)方(fang)法(fa)選(xuan)擇(ze)指南

不(bu)同類器(qi)官(guan)特性(xing)不同，適(shi)用的(de)傳(chuan)代(dai)方(fang)法(fa)也(ye)存(cun)在差異，具(ju)體選(xuan)擇(ze)可參(can)考以下指南：

• 碎(sui)片傳(chuan)代(dai)：是多數(shu)類器(qi)官(guan)的重(zhong)要方(fang)法(fa)，通(tong)過(guo)機(ji)械(xie)吹打獲得 50-200μm 的(de)細(xi)胞團(tuan)塊，既(ji)能(neng)兼(jian)顧(gu)細胞活(huo)性(xing)，又(you)能(neng)保(bao)留其(qi)分化(hua)潛力。

• 酶消(xiao)化法(fa)：適(shi)用於(yu)緊(jin)密(mi)連接(jie)的(de)上(shang)皮類器(qi)官(guan)，常用(yong) Tryple™Express 酶，操作時需(xu)嚴格(ge)控(kong)制(zhi)消(xiao)化時間(jian)，通常為(wei) 5-10 分(fen)鐘。

• 單(dan)細胞傳代(dai)：僅推(tui)薦用於克隆培(pei)養，且(qie)需添(tian)加(jia) ROCK 抑(yi)制(zhi)劑(ji)，以減(jian)少單細(xi)胞(bao)雕(diao)亡。

（三）現存(cun)問題(ti)：標(biao)準化(hua)瓶頸與技術挑戰(zhan)

盡(jin)管類器(qi)官(guan)傳代(dai)技(ji)術(shu)叠(die)代(dai)迅(xun)速(su)，但(dan)仍面臨(lin)兩(liang)大核(he)心挑戰。壹(yi)方(fang)面，傳(chuan)代(dai)參(can)數缺(que)乏(fa)統(tong)壹(yi)標(biao)準：肝(gan)癌(ai)類器(qi)官(guan)需 1:2 高(gao)比(bi)例(li)傳(chuan)代(dai)以維(wei)持(chi)增殖(zhi)活(huo)性(xing)，而(er)甲(jia)狀(zhuang)腺癌類器(qi)官(guan)則(ze)需(xu) 1:4 低(di)比(bi)例(li)傳(chuan)代(dai)避(bi)免(mian)過(guo)度擁(yong)擠，這(zhe)種組(zu)織(zhi)特異性差(cha)異導(dao)致跨實驗室(shi)數據可比(bi)性(xing)差(cha)。另(ling)壹(yi)方(fang)面，試(shi)劑(ji)盒兼(jian)容(rong)性不足(zu)：現有(you)商用試(shi)劑(ji)盒多針對腸道(dao)、乳腺等常見(jian)類器(qi)官(guan)開發，對膽(dan)管、胰腺等(deng)特(te)殊類型類器(qi)官(guan)的支持(chi)度有(you)限(xian)，

近(jin)年(nian)來，國(guo)產類器(qi)官(guan)培(pei)養試劑(ji)盒也是層出(chu)不窮(qiong)，比(bi)如濟研(yan)的(de)鼠源(yuan)類器(qi)官(guan)壹(yi)站式(shi)構(gou)建及傳代(dai)試(shi)劑(ji)盒、類器(qi)官(guan)專用(yong)組(zu)織(zhi)包埋膠（SE-Gel）等(deng)，采(cai)用(yong)納(na)米級親(qin)水塗層微(wei)孔(kong)板(ban)，支持(chi)鼠源(yuan)類器(qi)官(guan)懸(xuan)浮(fu)培(pei)養，無需基(ji)質膠包(bao)埋，傳代(dai)時直(zhi)接收集細胞(bao)球，避免(mian)酶解(jie)損傷，細(xi)胞(bao)存(cun)活率(lv)提(ti)升(sheng)至(zhi) 90% 以上；傳代(dai)後(hou)細(xi)胞倍(bei)增時間(jian)縮(suo)短(duan)至 24-36 小(xiao)時（傳(chuan)統(tong)培(pei)養基(ji)需 48-72 小(xiao)時）；經(jing) 10 + 種鼠(shu)源(yuan)腫瘤(liu)類器(qi)官(guan)（如胃癌、卵(luan)巢癌(ai)）傳(chuan)代(dai)驗(yan)證(zheng)，結(jie)構(gou)完(wan)整率(lv)達(da) 85% 以上，為(wei)後(hou)續(xu)標(biao)準化(hua)流程設(she)計(ji)與試劑(ji)盒選擇(ze)指南提(ti)供(gong)了(le)現實依據。

更(geng)多(duo)類器(qi)官(guan)培(pei)養試劑(ji)，基(ji)質膠，類器(qi)官(guan)培(pei)養基(ji)，試劑(ji)盒等實驗耗材請進(jin)入(ru)蘇(su)州(zhou)阿爾法生(sheng)物進(jin)行(xing)了(le)解(jie)。