熒光(guang)定量(liang)PCR儀(yi)在(zai)擴(kuo)增過程(cheng)中,如何(he)判斷擴(kuo)增產物(wu)是否為目標(biao)基(ji)因(yin)？

   在(zai)分(fen)子(zi)生(sheng)物(wu)學(xue)實驗(yan)中，熒光(guang)定量(liang) PCR 儀(yi)已成(cheng)為基因(yin)分(fen)析(xi)的(de)關(guan)鍵(jian)設備(bei)。對(dui)於使(shi)用熒光(guang)定量(liang) PCR 儀(yi)進行擴增的實(shi)驗(yan)，判斷擴(kuo)增產物(wu)是否為目標(biao)基(ji)因(yin)至關(guan)重(zhong)要(yao)。蘇州阿爾法生(sheng)物(wu)實驗(yan)器材有限公(gong)司作(zuo)為專業(ye)的實(shi)驗(yan)器材供(gong)應商(shang)，為眾(zhong)多(duo)科(ke)研及(ji)醫(yi)療客戶提供(gong)優質(zhi)的熒光(guang)定量(liang) PCR 儀(yi)及(ji)相關(guan)技術支(zhi)持(chi)。下面(mian)，我(wo)們(men)將詳(xiang)細介(jie)紹在(zai)熒光(guang)定量(liang) PCR 擴增過程(cheng)中判斷擴(kuo)增產物(wu)是否為目標(biao)基(ji)因(yin)的方法。

熒光(guang)定量(liang) PCR 儀(yi)的工(gong)作(zuo)原理簡(jian)述(shu)

熒光(guang)定量(liang) PCR 儀(yi)

     熒光(guang)定量(liang) PCR 儀(yi)是利(li)用熒光(guang)信號(hao)積累(lei)實時監(jian)測(ce)整個 PCR 進程(cheng)的儀(yi)器。在(zai) PCR 反(fan)應體(ti)系中(zhong)加入熒光(guang)基團(tuan)，隨著 PCR 反應的(de)進行，擴增產物(wu)不斷累(lei)積，熒光(guang)信號(hao)強(qiang)度也(ye)等比(bi)例增加。通(tong)過對(dui)熒光(guang)信號(hao)的(de)實時監(jian)測(ce)，可繪(hui)制(zhi)出(chu)熒光(guang)擴增曲線(xian)。常用的熒光(guang)標(biao)記(ji)方法有 SYBR Green 染料法和 TaqMan 探針(zhen)法(fa)。SYBR Green 染料能(neng)非(fei)特(te)異性(xing)地嵌入(ru) DNA 雙鏈小(xiao)溝，激(ji)發(fa)後發(fa)射(she)熒光(guang)，其(qi)熒光(guang)強度(du)與雙鏈 DNA 含量(liang)成(cheng)正(zheng)比。TaqMan 探針(zhen)法(fa)則(ze)是(shi)在(zai)引物(wu)之外設計壹條與(yu)目標(biao)序列(lie)互(hu)補的(de)寡核苷酸探針(zhen)，探針(zhen)兩(liang)端分(fen)別(bie)標(biao)記(ji)熒光(guang)報(bao)告(gao)基團(tuan)和淬(cui)滅(mie)基(ji)團(tuan)，在(zai) PCR 擴(kuo)增時，Taq 酶的 5'→3' 外切(qie)酶活(huo)性(xing)切(qie)割(ge)探針(zhen)，使(shi)報(bao)告(gao)基團(tuan)釋放(fang)熒光(guang)，熒光(guang)信號(hao)與(yu)目標(biao) DNA 拷(kao)貝(bei)數(shu)成(cheng)正(zheng)比。

基(ji)於熔(rong)解(jie)曲線(xian)分(fen)析(xi)判(pan)斷目(mu)標(biao)基(ji)因(yin)

  熔(rong)解(jie)曲線(xian)分(fen)析(xi)是(shi)熒光(guang)定量(liang) PCR 實驗(yan)中判(pan)斷擴(kuo)增產物(wu)特(te)異性(xing)的(de)重(zhong)要(yao)手(shou)段(duan)。在(zai) PCR 擴(kuo)增結(jie)束(shu)後，逐(zhu)漸(jian)升高溫(wen)度(du)，雙鏈 DNA 會解(jie)鏈成(cheng)為單(dan)鏈，此時熒光(guang)信號(hao)會(hui)發(fa)生(sheng)變化。對(dui)於目(mu)標(biao)基(ji)因(yin)的擴(kuo)增產物(wu)，其(qi)熔(rong)解(jie)溫(wen)度(du)（Tm 值(zhi)）是(shi)相對(dui)固(gu)定(ding)的(de)。因(yin)為不同(tong)的(de) DNA 序列(lie)具有不同(tong)的(de)堿基組成(cheng)和排列(lie)，GC 含(han)量高的 DNA 雙鏈相對(dui)更穩(wen)定(ding)，其(qi) Tm 值也(ye)較高。如果(guo)擴(kuo)增產物(wu)是單(dan)壹的目(mu)標(biao)基(ji)因(yin)，熔(rong)解(jie)曲線(xian)會呈現出單(dan)壹、尖銳(rui)的(de)峰(feng)。例如(ru)，在(zai)對(dui)某已知(zhi)基(ji)因(yin)進行擴增時，該基(ji)因(yin)的理論(lun) Tm 值(zhi)為 85℃，若實(shi)驗(yan)得到(dao)的(de)熔(rong)解(jie)曲線(xian)在(zai) 85℃左(zuo)右出現明(ming)顯(xian)單(dan)峰(feng)，且與(yu)陰性對(dui)照(zhao)（無模板）和非(fei)特(te)異性(xing)擴(kuo)增對(dui)照(zhao)（引物(wu)二(er)聚(ju)體(ti)等）的(de)熔(rong)解(jie)曲線(xian)有明(ming)顯(xian)差異，就(jiu)初步表(biao)明(ming)擴(kuo)增產物(wu)很可能(neng)是目標(biao)基(ji)因(yin)。而若熔(rong)解(jie)曲線(xian)出現多(duo)個峰(feng)，可(ke)能(neng)存在(zai)非(fei)特(te)異性(xing)擴(kuo)增，如引物(wu)二(er)聚(ju)體(ti)產(chan)生(sheng)的(de)峰，引物(wu)二(er)聚(ju)體(ti)的(de) Tm 值(zhi)通(tong)常較低，壹般在(zai) 70℃ - 80℃之(zhi)間，通(tong)過與目標(biao)基(ji)因(yin)理論(lun) Tm 值(zhi)對(dui)比以(yi)及(ji)經(jing)驗(yan)判斷，可(ke)以識(shi)別(bie)並排除。

基因(yin)測(ce)序

結(jie)合(he)引物(wu)設計與擴增片段(duan)大(da)小(xiao)判斷

  合(he)理的(de)引物(wu)設計是確保擴(kuo)增出目(mu)標(biao)基(ji)因(yin)的基(ji)礎。在(zai)設計引物(wu)時，要保(bao)證(zheng)引物(wu)與目標(biao)基(ji)因(yin)序列(lie)具有高度特(te)異性(xing)互(hu)補，並(bing)且(qie)避免(mian)引物(wu)自身(shen)或引物(wu)之間形(xing)成(cheng)二(er)聚(ju)體(ti)等結(jie)構(gou)。通(tong)過引物(wu)設計軟件，可以(yi)對(dui)引物(wu)的特(te)異性(xing)、Tm 值(zhi)、GC 含(han)量(liang)等參(can)數(shu)進行優化。當(dang)熒光(guang)定量(liang) PCR 擴增結(jie)束(shu)後，可通(tong)過瓊脂糖(tang)凝(ning)膠(jiao)電(dian)泳(yong)來(lai)檢測(ce)擴增產物(wu)的大(da)小(xiao)。目標(biao)基(ji)因(yin)的擴(kuo)增片段(duan)大(da)小(xiao)是已知(zhi)且(qie)固(gu)定(ding)的(de)，根(gen)據(ju)設計的引物(wu)擴增區(qu)域，可計算出理論(lun)的(de)擴(kuo)增片段(duan)長度(du)。例如(ru)，設計擴增某基(ji)因(yin)的壹段(duan) 150bp 的(de)片段(duan)，在(zai)凝(ning)膠(jiao)電(dian)泳(yong)中(zhong)，若觀(guan)察到(dao)清晰的條帶(dai)且(qie)其(qi)遷移(yi)位(wei)置(zhi)與 150bp 的 DNA Marker 位(wei)置(zhi)相符，結(jie)合(he)熒光(guang)定量(liang) PCR 的熒光(guang)信號(hao)情(qing)況，可進壹步佐(zuo)證擴(kuo)增產物(wu)為目標(biao)基(ji)因(yin)。若出(chu)現其(qi)他大(da)小(xiao)的條(tiao)帶(dai)，則可能(neng)存在(zai)非(fei)特(te)異性(xing)擴(kuo)增。 

測(ce)序驗(yan)證擴(kuo)增產物(wu)

   最(zui)為準(zhun)確(que)判斷擴(kuo)增產物(wu)是否為目標(biao)基(ji)因(yin)的方法是對(dui)擴增產物(wu)進行測(ce)序。將熒光(guang)定量(liang) PCR 擴增得到(dao)的(de)產(chan)物(wu)進行純(chun)化後，送至(zhi)專業(ye)的測(ce)序公(gong)司進行測(ce)序。通(tong)過測(ce)序得到(dao)的(de)堿(jian)基序列(lie)與(yu)目標(biao)基(ji)因(yin)的已知(zhi)序列(lie)進行比對(dui)，如果(guo)匹(pi)配，那麽可以(yi)確(que)鑿(zao)地證明(ming)擴(kuo)增產物(wu)就(jiu)是目(mu)標(biao)基(ji)因(yin)。這(zhe)種(zhong)方法雖然(ran)成(cheng)本較高且操(cao)作(zuo)相對(dui)復(fu)雜(za)，但在(zai)科(ke)研工作(zuo)中，當(dang)對(dui)實驗(yan)結(jie)果(guo)的(de)準(zhun)確(que)性要求高，或對(dui)擴增產物(wu)的性質(zhi)存在(zai)疑(yi)問(wen)時，測(ce)序驗(yan)證是(shi)常用的手(shou)段(duan)。例如(ru)，在(zai)研究(jiu)新發(fa)現的基(ji)因(yin)或對(dui)疾病相關(guan)基(ji)因(yin)的精確分(fen)析(xi)中(zhong)，測(ce)序可以明(ming)確(que)擴(kuo)增產物(wu)是否發(fa)生(sheng)了(le)基因(yin)突變、缺失或(huo)插入等情(qing)況，為後續(xu)的研究(jiu)提供(gong)精準(zhun)的(de)數據(ju)支(zhi)持(chi)。

   熒光(guang)定量(liang) PCR 儀(yi)在(zai)擴(kuo)增過程(cheng)中，通(tong)過熔(rong)解(jie)曲線(xian)分(fen)析(xi)、結(jie)合(he)引物(wu)設計與擴增片段(duan)大(da)小(xiao)判斷以(yi)及(ji)測(ce)序驗(yan)證等多(duo)種方法的綜(zong)合(he)運用，能(neng)夠(gou)準(zhun)確(que)判斷擴(kuo)增產物(wu)是否為目標(biao)基(ji)因(yin)。蘇(su)州阿爾法生(sheng)物(wu)不(bu)僅(jin)提供(gong)高品(pin)質(zhi)的熒光(guang)定量(liang) PCR 儀(yi)，還可(ke)為客戶(hu)提供(gong)專業(ye)的技術咨(zi)詢(xun)與(yu)實驗(yan)方案(an)指(zhi)導，助(zhu)力(li)科(ke)研人員順(shun)利(li)開(kai)展(zhan)實驗(yan)，獲取(qu)準(zhun)確(que)可靠的(de)實(shi)驗(yan)結(jie)果(guo)。