密度梯(ti)度離心(xin)如(ru)何(he)選(xuan)擇離心(xin)機(ji)轉(zhuan)子？

密度梯(ti)度離心(xin)是(shi)壹種常(chang)用(yong)的分(fen)離技術(shu)，根(gen)據(ju)不(bu)同(tong)生物(wu)樣(yang)品(pin)的(de)特(te)性(xing)，合(he)理選(xuan)擇和(he)優(you)化(hua)水平(ping)轉子與(yu)角轉(zhuan)子在密度梯(ti)度離心(xin)實(shi)驗中(zhong)的應(ying)用比較(jiao)重要。以下(xia)將(jiang)從(cong)生(sheng)物(wu)樣(yang)品(pin)特(te)性(xing)、水(shui)平(ping)轉子和(he)角(jiao)轉子特(te)點(dian)出發(fa)，探(tan)討(tao)如何(he)進行(xing)優(you)化(hua)。

生(sheng)物(wu)樣(yang)品(pin)特(te)性(xing)分(fen)析

• 細(xi)胞大小(xiao)和密度：不同(tong)細(xi)胞大小(xiao)和密度差(cha)異顯著(zhu)。例(li)如(ru)，紅(hong)細(xi)胞密度相對(dui)較(jiao)高(gao)，而(er)淋(lin)巴(ba)細(xi)胞密度較(jiao)低。大細(xi)胞如(ru)巨噬細(xi)胞直(zhi)徑(jing)可(ke)達(da) 20 - 30μm，小(xiao)細(xi)胞如(ru)血(xue)小(xiao)板(ban)直(zhi)徑(jing)僅(jin) 1 - 4μm 。密度與(yu)細(xi)胞內(nei)成(cheng)分(fen)相關，富(fu)含細(xi)胞器(qi)的細(xi)胞密度更(geng)高。

• 細(xi)胞脆弱性：壹些(xie)細(xi)胞如(ru)白細(xi)胞較(jiao)為(wei)脆弱，在離心(xin)過(guo)程(cheng)中易(yi)受機(ji)械(xie)力(li)損傷，影響細(xi)胞活(huo)性(xing)和功(gong)能(neng)。而(er)細(xi)菌(jun)等微生(sheng)物(wu)細(xi)胞壁結(jie)構(gou)不同(tong)，對(dui)離心(xin)力(li)耐受性也不同(tong)。

• 樣品(pin)純度要求：在分(fen)離特(te)定(ding)細(xi)胞亞(ya)群時，如(ru)從(cong)外周(zhou)血(xue)中分(fen)離單核細(xi)胞，對(dui)純(chun)度要求較(jiao)高(gao)，需(xu)盡(jin)量減(jian)少(shao)其他(ta)細(xi)胞類(lei)型汙(wu)染(ran)。而(er)對(dui)於(yu)壹些(xie)初(chu)步富(fu)集(ji)細(xi)胞的(de)實(shi)驗，純(chun)度要求相對(dui)較(jiao)低。

水平(ping)轉子和(he)角(jiao)轉子特(te)點(dian)

• 水(shui)平(ping)轉子：在離心(xin)過(guo)程(cheng)中，離心(xin)管(guan)會(hui)逐(zhu)漸轉至(zhi)水(shui)平(ping)位置(zhi)，樣(yang)品(pin)顆(ke)粒(li)的(de)沈降路徑(jing)與(yu)離心(xin)力(li)方向垂(chui)直(zhi)。優(you)點(dian)是(shi)顆(ke)粒(li)沈(chen)降距離短，能(neng)快(kuai)速達到平(ping)衡位置(zhi)，適(shi)用(yong)於(yu)分(fen)離較(jiao)大顆(ke)粒(li)或(huo)對(dui)時(shi)間(jian)敏感的樣品。缺點(dian)是(shi)由於(yu)離心(xin)管(guan)水(shui)平(ping)放(fang)置(zhi)，樣(yang)品(pin)在離心(xin)過(guo)程(cheng)中所(suo)受離心(xin)力(li)不(bu)均(jun)勻，邊(bian)緣(yuan)部(bu)分(fen)受力(li)較(jiao)大，可(ke)能(neng)影響分(fen)離效(xiao)果(guo)。

• 角(jiao)轉(zhuan)子：離心(xin)管(guan)與(yu)旋(xuan)轉軸成(cheng)壹定角度固定(ding)，離心(xin)時(shi)離心(xin)力(li)方向與(yu)管(guan)壁平(ping)行(xing)。優(you)點(dian)是(shi)能提供(gong)較(jiao)高(gao)的離心(xin)力(li)，樣(yang)品(pin)在離心(xin)管(guan)內(nei)分(fen)布均(jun)勻，分(fen)離效(xiao)果(guo)好(hao)，適(shi)用(yong)於(yu)分(fen)離較(jiao)小(xiao)顆(ke)粒(li)或(huo)對(dui)分(fen)辨(bian)率要(yao)求高的(de)實(shi)驗。缺(que)點(dian)是(shi)顆(ke)粒(li)沈(chen)降距離長，所(suo)需(xu)離心(xin)時(shi)間較(jiao)長(chang)。

優(you)化(hua)應用策略(lve)

1. 基於(yu)細(xi)胞大小(xiao)和密度的優(you)化(hua)

• 大細(xi)胞或(huo)低密度細(xi)胞：對(dui)於(yu)大細(xi)胞如(ru)巨噬細(xi)胞，水(shui)平(ping)轉子是(shi)較(jiao)好(hao)選(xuan)擇。其(qi)較(jiao)短(duan)的沈降路徑(jing)可(ke)減(jian)少(shao)離心(xin)時(shi)間，降低大細(xi)胞受損風(feng)險。例(li)如(ru)在分(fen)離植(zhi)物(wu)原(yuan)生(sheng)質(zhi)體(ti)時，由(you)於(yu)原生(sheng)質體(ti)體(ti)積大且(qie)脆弱，使用水(shui)平(ping)轉子能(neng)快(kuai)速將(jiang)其沈(chen)降到合(he)適(shi)位(wei)置(zhi)，保(bao)持細(xi)胞完整(zheng)性(xing)。對(dui)於(yu)低密度細(xi)胞，如(ru)淋巴細(xi)胞，水(shui)平(ping)轉子也能利用其(qi)相對(dui)較(jiao)快(kuai)的沈(chen)降(jiang)速度，避免(mian)細(xi)胞長(chang)時間暴露在高(gao)離心(xin)力(li)下(xia)。

• 小(xiao)細(xi)胞或(huo)高密度細(xi)胞：角(jiao)轉子更(geng)適(shi)合(he)小(xiao)細(xi)胞或(huo)高密度細(xi)胞。如(ru)在分(fen)離細(xi)菌(jun)時，角(jiao)轉(zhuan)子能(neng)提供(gong)足夠離心(xin)力(li)使(shi)細(xi)菌(jun)快(kuai)速沈降，且(qie)離心(xin)力(li)均(jun)勻分(fen)布，有(you)助於(yu)提高(gao)分(fen)離純度。對(dui)於(yu)紅細(xi)胞等高密度細(xi)胞，角(jiao)轉子可(ke)使(shi)細(xi)胞在離心(xin)管(guan)內(nei)緊密排(pai)列(lie)，便於(yu)後續分(fen)離操作(zuo)。

2. 基(ji)於(yu)細(xi)胞脆弱性的優(you)化(hua)

• 脆弱細(xi)胞：對(dui)於(yu)脆弱細(xi)胞如(ru)白細(xi)胞，在選(xuan)擇水(shui)平(ping)轉子時(shi)，需(xu)適(shi)當(dang)降(jiang)低離心(xin)速度和時間(jian)，減(jian)少(shao)機(ji)械(xie)力(li)對(dui)細(xi)胞的(de)損傷。同(tong)時，可(ke)在密度梯(ti)度介質中(zhong)添(tian)加(jia)保(bao)護(hu)劑，如牛(niu)血(xue)清白(bai)蛋(dan)白，緩(huan)沖(chong)離心(xin)力(li)對(dui)細(xi)胞的(de)沖(chong)擊。若使用(yong)角轉(zhuan)子，應(ying)更(geng)謹慎地(di)控(kong)制(zhi)離心(xin)參(can)數(shu)，避(bi)免(mian)過高離心(xin)力(li)導(dao)致(zhi)細(xi)胞破(po)裂(lie)。

3. 基於(yu)樣品(pin)純度要求的優(you)化(hua)

• 高純度要求：當對(dui)樣(yang)品(pin)純(chun)度要求高時(shi)，如(ru)從(cong)外周(zhou)血(xue)中分(fen)離高純(chun)度單核細(xi)胞，角(jiao)轉子由(you)於(yu)其均(jun)勻的(de)離心(xin)力(li)分(fen)布和(he)較(jiao)好(hao)的分(fen)辨(bian)率，能(neng)更(geng)好(hao)地將(jiang)單核細(xi)胞與(yu)其他(ta)細(xi)胞分(fen)離開(kai)來(lai)。在實(shi)驗過(guo)程(cheng)中，可(ke)優(you)化(hua)密度梯(ti)度介質的(de)組(zu)成(cheng)和濃(nong)度，如采用(yong)不(bu)連(lian)續(xu)密度梯(ti)度，進壹(yi)步提高(gao)分(fen)離純度。

• 低純度要求：對(dui)於(yu)純度要求相對(dui)較(jiao)低的實(shi)驗，如(ru)初(chu)步富(fu)集(ji)細(xi)胞用(yong)於(yu)後續培(pei)養，水平(ping)轉子可(ke)利(li)用其(qi)快(kuai)速沈降的特(te)點(dian)，節(jie)省(sheng)實(shi)驗時(shi)間。可(ke)適(shi)當(dang)調(tiao)整離心(xin)速度和時間(jian)，在滿(man)足實(shi)驗需(xu)求的前(qian)提下(xia)提高(gao)效(xiao)率。

4. 其(qi)他(ta)優(you)化(hua)措(cuo)施

• 密度梯(ti)度介質選(xuan)擇：根(gen)據(ju)生(sheng)物(wu)樣(yang)品(pin)特(te)性(xing)選(xuan)擇合(he)適(shi)的(de)密度梯(ti)度介質。如(ru)分(fen)離蛋(dan)白質(zhi)常(chang)用(yong)蔗(zhe)糖(tang)、甘油(you)等，分(fen)離細(xi)胞常(chang)用(yong) Ficoll - Paque 等。不同(tong)介質(zhi)的密度範圍、粘(zhan)度等特(te)性(xing)會(hui)影響離心(xin)效(xiao)果(guo)，需(xu)根(gen)據(ju)實(shi)際(ji)情(qing)況優(you)化(hua)選(xuan)擇。

• 離心(xin)參(can)數(shu)調(tiao)整：除了離心(xin)速度和時間(jian)，還(hai)需(xu)考(kao)慮加速度和減(jian)速度。對(dui)於(yu)脆弱細(xi)胞，應(ying)采用較(jiao)低的加速度和減(jian)速度，減(jian)少(shao)對(dui)細(xi)胞的(de)沖(chong)擊。同(tong)時，定(ding)期校準(zhun)離心(xin)機(ji)，確保(bao)離心(xin)參(can)數(shu)準(zhun)確可(ke)靠。