細(xi)胞(bao)培養(yang)前的滅菌(jun)處(chu)理技(ji)術(shu)

    無(wu)論從(cong)事(shi)何種(zhong)細(xi)胞(bao)培養(yang)，無(wu)菌技(ji)術(shu)都(dou)是(shi)絕(jue)對最重(zhong)要(yao)的部分(fen)。細(xi)胞(bao)培養(yang)前的無(wu)菌處(chu)理技(ji)術(shu)分(fen)為三部分(fen)即：①工作(zuo)環境(jing)及(ji)表面(mian)的(de)處(chu)理；②細(xi)胞(bao)培養(yang)所用(yong)玻(bo)璃(li)及(ji)塑(su)料制品(pin)的處(chu)理；③實驗者(zhe)的(de)操(cao)作(zuo)技術(shu)；還(hai)有(you)哺(bu)乳(ru)動物細(xi)胞(bao)的(de)處(chu)理及(ji)維(wei)持細(xi)胞(bao)生(sheng)長所需要(yao)的培養(yang)液(ye)的(de)無(wu)菌處(chu)理。

1.工(gong)作(zuo)環境(jing)的(de)無(wu)菌處(chu)理

在(zai)細(xi)胞(bao)培養(yang)早(zao)期，研(yan)究(jiu)者(zhe)可(ke)以(yi)依靠操作(zuo)技術(shu)和(he)盡(jin)可(ke)能(neng)地(di)靠近火焰以(yi)達到細(xi)胞(bao)的(de)無(wu)菌化(hua)，隨(sui)著工(gong)作(zuo)環境(jing)的(de)機械(xie)學(xue)發(fa)展，其(qi)無(wu)菌化(hua)程(cheng)度已得到大(da)大(da)提高，免去了實(shi)驗者(zhe)手指(zhi)被(bei)燒灼的(de)痛(tong)苦(ku)。層流(liu)超(chao)凈(jing)臺(tai)是使(shi)工(gong)作(zuo)臺(tai)無(wu)菌化(hua)有(you)效(xiao)的(de)手段(duan)，組(zu)織培養(yang)可(ke)在相對密(mi)閉(bi)而幾乎(hu)無(wu)對工(gong)作(zuo)面外界(jie)氣(qi)流(liu)幹(gan)擾(rao)的區(qu)域內進(jin)行(xing)。更周(zhou)密(mi)(但(dan)較(jiao)吊(diao)貴(gui))的用(yong)於(yu)隔(ge)離(li)無(wu)菌場(chang)所的設(she)備(bei)就和(he)用(yong)於(yu)手術(shu)間(jian)的設備(bei)相似，通(tong)過(guo)該場所的空氣均(jun)經過HEPA過(guo)濾層後循環使(shi)用(yong)，通(tong)過(guo)出(chu)口處(chu)的氣流(liu)形(xing)式(shi)為向(xiang)下和(he)向(xiang)外的(de)。超(chao)凈(jing)臺(tai)的使(shi)用(yong)允許研究(jiu)者(zhe)將(jiang)實(shi)驗 室(shi)的壹(yi)角(jiao)轉變為組(zu)織培養(yang)區(qu)域，這種(zhong)工(gong)作(zuo)臺(tai)甚至在空氣經過HEPA過(guo)濾的房間(jian)中也有其(qi)便(bian)利(li)之處(chu)。空氣源汙(wu)染(ran)主要(yao)是由(you)於(yu)氣(qi)流(liu)和(he)煙(yan)霧(wu)進(jin)入(ru)培養(yang)瓶或(huo)培養(yang)液(ye)汙(wu)染(ran)所致，實(shi)際(ji)上保持無(wu)菌間(jian)足夠(gou)清潔(jie)而無(wu)汙染(ran)物的堆(dui)積不(bu)太可能(neng)，而超(chao)凈(jing)臺(tai)即可提供容(rong)易(yi)清潔(jie)並(bing)可保持的(de)良(liang)好工作(zuo)臺(tai)。此外，超(chao)凈(jing)臺(tai)在研究(jiu)者(zhe)坐(zuo)方對面(mian)的開(kai)放的(de)前部形(xing)成(cheng)壹(yi)種(zhong)向(xiang)下的氣(qi)流(liu)屏(ping)障。

   超(chao)凈(jing)臺(tai)正常(chang)工作(zuo)時，向(xiang)下的氣(qi)流(liu)可(ke)阻(zu)擋外界(jie)空氣汙染物進(jin)入(ru)超(chao)凈(jing)臺(tai)。超(chao)凈(jing)臺(tai)HEPA過濾層應在每(mei)年(nian)或(huo)壹年(nian)後由(you)被(bei)認(ren)可的機(ji)構進(jin)行(xing)維(wei)修(xiu)。購買(mai)超(chao)凈(jing)臺(tai)時應壹同購(gou)買(mai)內(nei)部電源、真(zhen)空泵和(he)氣體(ti)的內部出口。在某些情況下(xia)，研(yan)究(jiu)者(zhe)可(ke)在(zai)超(chao)凈(jing)臺(tai)中安裝空氣噴射裝置(zhi)；超(chao)凈(jing)臺(tai)通(tong)常(chang)裝(zhuang)有(you)紫(zi)外燈(deng)。水平氣(qi)流(liu)的(de)超(chao)凈(jing)臺(tai)不宜使(shi)用(yong)，因為氣(qi)流(liu)直(zhi)接(jie)吹(chui)向(xiang)研究(jiu)者(zhe)，而(er)可(ke)能(neng)導(dao)致操作(zuo)者(zhe)無(wu)率的(de)受(shou)到可能(neng)來(lai)白(bai)實驗器材(cai)上的病原菌汙染(ran)。同樣(yang)道理，從(cong)工(gong)作(zuo)臺(tai)吹出的氣流(liu)在(zai)吹(chui)到周(zhou)圍(wei)環境(jing)前也應先(xian)通(tong)過(guo)隔(ge)離(li)的(de)HEPA過(guo)濾層蓄積，達到杜(du)絕(jue)細(xi)菌(jun)和(he)真(zhen)菌繁(fan)殖(zhi)的目(mu)的(de)。工(gong)作(zuo)臺(tai)內只限(xian)放(fang)置(zhi)每(mei)日(ri)工作(zuo)所必湍的物品，其(qi)他非(fei)必(bi)需(xu)物應去除。日(ri)常的(de)清潔(jie)工作(zuo)包括(kuo)用(yong)70%乙醇或(huo)10%新潔(jie)爾滅擦(ca)洗工作(zuo)臺(tai)，用(yong)壹(yi)個(ge)連(lian)接(jie)到真(zhen)空泵的密閉(bi)容器作(zuo)為裝(zhuang)廢(fei)棄(qi)液(ye)的(de)容(rong)器。該容器應隨(sui)操作(zuo)內容(rong)改(gai)變後進(jin)行(xing)高壓(ya)處(chu)理後(hou)再(zai)放(fang)入(ru)超(chao)凈(jing)臺(tai)內：加入(ru)20ml新(xin)潔(jie)爾滅有(you)助(zhu)幹(gan)防(fang)止微生(sheng)物在其(qi)中(zhong)的滋(zi)生(sheng)繁殖(zhi)，減少(shao)廢(fei)液(ye)的(de)汙(wu)染度(du)、不要(yao)使(shi)用(yong)開(kai)放(fang)的(de)燒杯或(huo)容器裝廢(fei)液(ye)，也不宜(yi)采用(yong)傾(qing)倒操(cao)作(zuo)丟(diu)弁、廢(fei)棄(qi)的(de)培養(yang)液(ye)，因為這操(cao)作(zuo)都(dou)可(ke)導(dao)致(zhi)廢(fei)液(ye)的(de)氣(qi)霧化(hua)，從(cong)而(er)能導致(zhi)微小塵粒(li)再(zai)次(ci)進(jin)入(ru)細(xi)胞(bao)培養(yang)瓶中。

2.玻(bo)璃器具和(he)塑料(liao)制品(pin)的無(wu)菌處(chu)理

  壹(yi)次(ci)性用(yong)品(pin)。細(xi)胞(bao)培養(yang)瓶或(huo)培養(yang)皿(min)經適(shi)當處(chu)理後(hou)使(shi)細(xi)胞(bao)更易附著(zhe)，通(tong)常(chang)單(dan)層細(xi)胞(bao)培養(yang)物在塑(su)料瓶比(bi)玻璃(li)瓶中更易附著(zhe)、生(sheng)長更快。塑料(liao)瓶本身無(wu)活(huo)性(xing)，更適(shi)宜(yi)在(zai)4℃儲(chu)存(cun)溶液(ye)；而(er)凍存(cun)管則宜使(shi)用(yong)玻(bo)璃(li)制品(pin)，因為其(qi)可(ke)耐受(shou)0℃以(yi)下低(di)溫(wen)。

  盡(jin)管(guan)塑(su)料吸管、瓶子比(bi)起(qi)玻璃(li)器材(cai)有其(qi)優(you)點(dian)，但其(qi)價(jia)格昂(ang)貴(gui).因為玻(bo)璃(li)制品(pin)可反(fan)復(fu)使(shi)用(yong)。但(dan)處(chu)理玻(bo)璃(li)器材(cai)設備(bei)有(you)限(xian)或(huo)沒有的(de)實驗室(shi)，選擇(ze)塑(su)料(liao)制品(pin)更為合(he)適(shi)。

   利(li)用(yong)高壓(ya)滅菌(jun)器進(jin)行(xing)組(zu)織培養(yang)器材(cai)的蒸(zheng)氣(qi)滅菌(jun)是(shi)常(chang)用(yong)的(de)滅菌(jun)方法(fa)。玻(bo)璃(li)器材(cai)應采用(yong)高壓(ya)滅菌(jun)後(hou)快速風(feng)幹(gan)法(fa)蒸(zheng)發(fa)冷(leng)凝氣(qi)。瓶蓋應松松地(di)蓋在瓶口上進(jin)行(xing)高壓(ya)滅菌(jun)，瓶子的(de)消毒也可采取瓶口鋁(lv)箔(bo)包(bao)裹(guo)，瓶蓋單(dan)獨(du)消毒(du)的方法(fa)，待(dai)冷(leng)卻至(zhi)室(shi)溫(wen)後(hou)在超(chao)凈(jing)臺(tai)中再(zai)蓋(gai)在(zai)瓶口上。玻璃吸(xi)管(guan)應塞上棉(mian)花(hua)後(hou)再(zai)進(jin)行(xing)滅菌(jun)，然(ran)後(hou)置(zhi)烤箱中烘(hong)幹(gan)以(yi)免棉(mian)塞殘留水(shui)份(fen)，應遵照高壓(ya)滅菌(jun)器材(cai)生(sheng)產(chan)廠家推薦(jian)的有(you)效(xiao)的(de)高壓(ya)滅菌(jun)方法(fa)進(jin)行(xing)操(cao)作(zuo)。高壓(ya)滅菌(jun)法(fa)的(de)效(xiao)果(guo)取決於(yu)其(qi)蒸(zheng)汽(qi)壓(ya)力(li)和(he)高熱狀(zhuang)態(tai)。許多(duo)溶液(ye)(如(ru)Tris緩(huan)沖(chong)液(ye)，細(xi)胞(bao)培養(yang)液(ye))不(bu)應采用(yong)高壓(ya)滅菌(jun)法(fa)進(jin)行(xing)消(xiao)毒(du)，而(er)用(yong)於(yu)微生(sheng)物培養(yang)的(de)培養(yang)液(ye)及(ji)多(duo)種(zhong)鹽(yan)溶液(ye)宜(yi)采用(yong)“緩(huan)慢耗竭(jie)"及(ji)“濕 氣"循環法(fa)以(yi)防(fang)液(ye)體(ti)蒸(zheng)發。不(bu)宜進(jin)行(xing)高壓(ya)滅菌(jun)的(de)瓶塞和(he)其(qi)他用(yong)品(pin)可(ke)浸(jin)泡(pao)在70%乙醇中(zhong)進(jin)行(xing)消(xiao)毒(du)，並(bing)在超(chao)凈(jing)工作(zuo)臺(tai)上吹幹(gan)。

3.無(wu)菌操(cao)作(zuo)

  無(wu)菌操(cao)作(zuo)的原則就是(shi)保證細(xi)胞(bao)培養(yang)皿(min)、培養(yang)瓶內部以(yi)及吸(xi)管包(bao)裹層等(deng)內(nei)部的無(wu)菌狀(zhuang)態(tai)。細(xi)胞(bao)培養(yang)需(xu)要(yao)比(bi)外科(ke)手術(shu)更加嚴(yan)格的無(wu)菌操(cao)作(zuo)，因為離(li)體(ti)細(xi)胞(bao)沒有免疫(yi)防(fang)禦系(xi)統有(you)幾種(zhong)操(cao)作(zuo)規程(cheng)有助於(yu)無(wu)菌技(ji)術(shu)的(de)掌握。細(xi)胞(bao)培養(yang)應在超(chao)凈(jing)工作(zuo)臺(tai)或(huo)有空氣濾過裝(zhuang)置(zhi)的工作(zuo)間(jian)裏進(jin)行(xing)；培養(yang)用(yong)液(ye)或(huo)其(qi)他溶液(ye)不(bu)應在工作(zuo)區(qu)以(yi)外打(da)開，裝吸(xi)管(guan)的(de)鐵(tie)筒同樣(yang)如此勿使(shi)用(yong)先(xian)前已打(da)開的(de)吸管(guan)簡裏的(de)吸管(guan)。壹(yi)旦筒蓋打開，盡(jin)量(liang)將(jiang)筒內吸管用(yong)完(wan)，如(ru)當天(tian)尚未(wei)用(yong)完(wan)，應從超(chao)凈(jing)工作(zuo)臺(tai)內取出(chu)，補(bu)充洗凈的吸管(guan)，然(ran)後(hou)重(zhong)新進(jin)行(xing)滅菌(jun)處(chu)理後(hou)備(bei)用(yong)。超(chao)凈(jing)臺(tai)在實驗完畢後應騰空，並(bing)用(yong)適(shi)當的消(xiao)毒液(ye)擦(ca)洗桌(zhuo)面(mian)。

   對細(xi)胞(bao)培養(yang)者(zhe)來(lai)說(shuo)，壹(yi)次性乳(ru)膠手套的使(shi)用(yong)被(bei)視(shi)為壹(yi)種(zhong)安(an)全(quan)的象(xiang)征。但(dan)切記手套本身並(bing)不需(xu)要(yao)無(wu)菌。細(xi)胞(bao)培養(yang)中(zhong)液(ye)體(ti)的(de)吸取，均(jun)需機(ji)械(xie)移液(ye)裝(zhuang)置(zhi)。采用(yong)口吸是最大(da)的微生(sheng)物汙染(ran)源，更重要(yao)的是(shi)細(xi)胞(bao)培養(yang)液(ye)及(ji)成(cheng)分(fen)通(tong)過(guo)食(shi)入(ru)或(huo)吸入(ru)方式(shi)進(jin)入(ru)入(ru)體(ti)，可能(neng)對研(yan)究(jiu)人(ren)員造成(cheng)危害(hai)。

   細(xi)胞(bao)培養(yang)中(zhong)用(yong)的(de)各(ge)種(zhong)瓶子僅(jin)在超(chao)凈(jing)工作(zuo)臺(tai)中打開，瓶蓋應蓋頂朝(chao)下(xia)放(fang)置(zhi)於(yu)工(gong)作(zuo)臺(tai)上，勿將瓶蓋放(fang)在非(fei)無(wu)茵工作(zuo)區(qu)，如果(guo)瓶蓋的(de)邊(bian)緣已汙(wu)染，就可(ke)能通(tong)過(guo)與瓶口的接觸(chu)而(er)汙染瓶中的(de)培養(yang)液(ye)或(huo)吸管(guan)、廢(fei)棄(qi)吸(xi)管(guan)、細(xi)胞(bao)培養(yang)瓶等(deng)應放入(ru)可(ke)封裝(zhuang)的(de)容(rong)器中，對可(ke)能含(han)有潛在(zai)的(de)生(sheng)物有害(hai)物質的(de)物品應采用(yong)焚(fen)燒和(he)/或(huo)高壓(ya)火菌(jun)法(fa)進(jin)行(xing)處(chu)理，這是(shi)壹種(zhong)大(da)家廣(guang)為采用(yong)的(de)安(an)全(quan)措(cuo)施(shi)。

    濕潤(run)的培養(yang)箱(xiang)是常(chang)見(jian)的汙(wu)染(ran)源。通(tong)常(chang)由(you)充(chong)滿(man)液(ye)體(ti)的(de)托盤(pan)提供(gong)培養(yang)箱(xiang)合適(shi)的(de)度(du)，而(er)托(tuo)盤(pan)本身即(ji)可(ke)導致(zhi)各(ge)種(zhong)細(xi)菌(jun)和(he)真(zhen)菌的(de)汙(wu)染，這種(zhong)汙(wu)染還存(cun)在於(yu)培養(yang)箱(xiang)壁上和(he)提供(gong)氣體的管道上。這些培養(yang)箱(xiang)應定(ding)期在(zai)細(xi)胞(bao)移至(zhi)其(qi)他培養(yang)箱(xiang)後進(jin)行(xing)加(jia)熱處(chu)理(如(ru)果(guo)有加熱程(cheng)序的話(hua)),或(huo)采用(yong)70%乙醇擦(ca)洗表面，並(bing)定(ding)期更換輸(shu)送(song)C02的(de)管 道。該管子可(ke)置(zhi)於(yu)20%的(de)含(han)氯(lv)漂白(bai)劑中浸(jin)泡(pao)以(yi)達到消毒(du)目(mu)的(de)。采用(yong)高熱於(yu)燥(zao)法(fa)是(shi)壹(yi)種(zhong)相當有效(xiao)的(de)消(xiao)除細(xi)菌(jun)、真(zhen)菌甚(shen)至真(zhen)菌孢(bao)子的(de)方法(fa)。C02培養(yang)箱(xiang)中托(tuo)盤(pan)始(shi)終用(yong)飽和(he)濃度的(de)磷酸氫二(er)鈉(Na2HPO4)液(ye)體(ti)達到盤(pan)中的(de)高鹽(yan)濃度，既使(shi)得細(xi)菌(jun)不(bu)能(neng)在其(qi)中(zhong)生(sheng)長，而(er)又(you)能(neng)提供(gong)合適(shi)的(de)濕(shi)度(du).每(mei)周(zhou)均(jun)應 補(bu)充無(wu)菌雙(shuang)蒸水(shui)，而(er)Na2HPO4應在無(wu)固(gu)體鹽(yan)出現時加(jia)入(ru)。

   為了防(fang)止細(xi)胞(bao)系(xi)的交叉(cha)汙染(ran)，超(chao)凈(jing)臺(tai)中應只進(jin)行(xing)壹(yi)種(zhong)細(xi)胞(bao)系(xi)的操(cao)作(zuo)。較理想(xiang)的方式(shi)是每(mei)種(zhong)細(xi)胞(bao)系(xi)使(shi)用(yong)兩(liang)瓶各(ge)自單(dan)獨(du)的培養(yang)液(ye)，以(yi)免壹旦出(chu)現汙染(ran)導致(zhi)全(quan)部細(xi)胞(bao)的(de)汙(wu)染。這點(dian)對進(jin)行(xing)克(ke)隆(long)的(de)衍生(sheng)株(zhu)或(huo)尚未(wei)凍存(cun)的新(xin)建(jian)立的細(xi)胞(bao)系(xi)特別重要(yao)。超(chao)凈(jing)工作(zuo)臺(tai)中應盡(jin)可(ke)能(neng)不放置(zhi)任何設備(bei)和(he)器材(cai)，以(yi)避免由於(yu)偶然接觸(chu)有(you)菌物品導(dao)致(zhi)的汙染(ran)。在層流(liu)超(chao)凈(jing)臺(tai)中，允許培養(yang)液(ye)瓶口敞開，因為空氣是經過過(guo)濾後進(jin)入(ru)工(gong)作(zuo)臺(tai)的，所以(yi)進(jin)入(ru)開(kai)口的瓶內的(de)空氣是過濾的空氣。但是提倡(chang)在(zai)培養(yang)液(ye)不(bu)使(shi)用(yong)時(shi)將(jiang)瓶口蓋緊(jin)，以(yi)免因為偶爾碰到瓶口或(huo)拿放(fang)非(fei)無(wu)菌物品通(tong)過(guo)開(kai)放(fang)的(de)瓶頸時(shi)使(shi)衣(yi)袖上或(huo)其(qi)他非(fei)無(wu)菌物品的(de)細(xi)菌(jun)掉(diao)落(luo)到培養(yang)液(ye)中(zhong)。培養(yang)箱(xiang)中的(de)細(xi)胞(bao)應經常置(zhi)顯微鏡下(xia)觀察(cha)，每(mei)周(zhou)至(zhi)少(shao)兩(liang)次，以(yi)確定(ding)細(xi)胞(bao)的(de)生(sheng)長狀(zhuang)態(tai)或(huo)有無(wu)明(ming)顯的汙染存(cun)在。不(bu)再(zai)需(xu)要(yao)的細(xi)胞(bao)應該 立即丟(diu)棄(qi)，而(er)不(bu)是繼續(xu)留(liu)在CO2培養(yang)箱(xiang)中。

      我們是(shi)壹(yi)家有著14年(nian)實驗室(shi)儀(yi)器行業經驗的供應商，除了球(qiu)磨儀(yi)、行(xing)星式(shi)球(qiu)磨儀(yi)、刀(dao)片式(shi)研磨儀(yi)，蘇州(zhou)阿爾(er)法(fa)生(sheng)物還提(ti)供(gong) 各(ge)種(zhong)高質(zhi)量的(de)實驗室(shi) 儀(yi)器，例如移液(ye)器、生(sheng)物反(fan)應器、發酵(jiao)罐、液(ye)氮(dan)罐、超(chao)純水機(ji)、天(tian)平、 高速 離(li)心(xin)機(ji)、臺(tai)式(shi)離(li)心(xin)機(ji)、迷(mi)妳離(li)心(xin)機(ji)、低(di)溫(wen)高速離(li)心(xin)機(ji)、潔(jie)凈工(gong)作(zuo)臺(tai)等(deng)，以(yi)滿足生(sheng)物實驗室(shi)的各(ge)種(zhong)需(xu)求。

        除此之外，我們還(hai)提(ti)供各(ge)種(zhong)實(shi)驗室(shi)設備(bei)，例如移液(ye)器、生(sheng)物反(fan)應器、發酵(jiao)罐、液(ye)氮(dan)罐、超(chao)純水機(ji)、天(tian)平、高速離(li)心(xin)機(ji)、臺(tai)式(shi)離(li)心(xin)機(ji)、迷(mi)妳離(li)心(xin)機(ji)、低(di)溫(wen)高速離(li)心(xin)機(ji)、潔(jie)凈工(gong)作(zuo)臺(tai)等(deng)，以(yi)滿足生(sheng)物實驗室(shi)的各(ge)種(zhong)需(xu)求。我們還(hai)提(ti)供多(duo)能(neng)幹(gan)細(xi)胞(bao)、成(cheng)骨(gu)誘導分(fen)化(hua)培養(yang)基(ji)、骨髓(sui)幹(gan)細(xi)胞(bao)、胚(pei)胎(tai)幹(gan)細(xi)胞(bao)、腫(zhong)瘤(liu)細(xi)胞(bao)、潔(jie)凈車(che)間(jian)消毒液(ye)等(deng)上千個產(chan)品，品類豐(feng)富(fu)齊(qi)全(quan)，能夠(gou)根據客(ke)戶的需求提供樣(yang)機體驗性能服務(wu)。