懸(xuan)浮細(xi)胞(bao)的電(dian)融(rong)合轉染(ran)技術簡介

懸(xuan)浮細(xi)胞(bao)的電(dian)融(rong)合轉染(ran)技術
融合懸浮細(xi)胞(bao)的步(bu)驟與(yu)電(dian)穿孔(kong)的(de)很類(lei)似(si)，只是在進行高強(qiang)度(du)的電(dian)場(chang)脈沖(chong)前後(hou)，必(bi)須用低(di)幅(fu)、高頻電(dian)場(chang)使細(xi)胞(bao)排(pai)成壹(yi)條(tiao)鏈。
1 用(yong)融(rong)合介質(zhi)（FM）洗(xi)懸(xuan)浮細(xi)胞(bao)兩(liang)次(ci)，然後懸於(yu)FM中(zhong)。洗(xi)滌(di)細(xi)胞(bao)時(shi)，在臺(tai)式(shi)離(li)心機上1000rpm下離心3分(fen)鐘，得(de)到(dao)細(xi)胞(bao)沈澱(dian)，棄去上清液將細(xi)胞(bao)懸於(yu)新(xin)鮮(xian)FM介質(zhi)中(zhong)。
2 將懸(xuan)浮細(xi)胞(bao)轉移到相(xiang)應的融(rong)合室(shi)內。假如要使兩(liang)種不同的(de)細(xi)胞(bao)彼此(ci)融(rong)合，轉移前要充(chong)分(fen)混(hun)合。
3 啟(qi)動介電(dian)電(dian)泳(yong)場，其(qi)振(zhen)幅(fu)通(tong)常(chang)小於(yu)200V/cm，頻率在2MHz以內(nei)，用顯(xian)微(wei)鏡檢測(ce)細(xi)胞(bao)是否排(pai)成壹(yi)條(tiao)鏈，調(tiao)節(jie)振幅(fu)和(he)頻率以達(da)到最佳(jia)效(xiao)果。
4 讓(rang)介電(dian)電(dian)泳(yong)場開(kai)約1分(fen)鐘後(hou)關掉(diao)，立即(ji)應用融(rong)合脈沖(chong)，其振(zhen)幅(fu)數(shu)量(liang)級為1kV/cm。脈沖(chong)寬度(du)小(xiao)於(yu)1ms。在進行融合脈沖(chong)後立即(ji)再(zai)次啟(qi)動介電(dian)電(dian)泳(yong)場，常(chang)規讓(rang)其(qi)開啟(qi)約2分(fen)鐘。
5 關掉(diao)介電(dian)電(dian)泳(yong)場，讓(rang)細(xi)胞(bao)在樣品(pin)池中(zhong)靜置10分(fen)鐘。
6 去掉(diao)FM，用普(pu)通培(pei)養(yang)基(ji)再(zai)次(ci)洗(xi)滌(di)細(xi)胞(bao)。
7 將細(xi)胞(bao)轉移到培養(yang)皿(min)，加(jia)入普(pu)通培(pei)養(yang)基(ji)，在培養(yang)箱壹(yi)般(ban)條(tiao)件下培養(yang)。

[註(zhu)意事項]
1 適宜組(zu)分(fen)依(yi)使用(yong)的(de)特(te)定(ding)細(xi)胞(bao)種類而有(you)變化。如果(guo)努力優(you)化電(dian)壓(ya)和(he)脈(mai)沖(chong)寬度(du)電(dian)穿孔(kong)結果仍不令(ling)人滿(man)意，就應嘗試(shi)改(gai)變穿孔(kong)介質(zhi)。
2 影(ying)響電(dian)穿孔(kong)/電(dian)融(rong)合的另(ling)壹(yi)重要因素(su)與細(xi)胞(bao)狀態有(you)關，為(wei)達(da)到高效(xiao)率，必(bi)須收集對(dui)數(shu)生(sheng)長中(zhong)期(qi)的(de)細(xi)胞(bao)。
1.純(chun)化siRNA
在轉染(ran)前要確認(ren)siRNA的(de)大(da)小和(he)純(chun)度(du)。為得(de)到(dao)高純(chun)度(du)的siRNA，推薦(jian)用玻璃纖維(wei)結合，洗(xi)脫(tuo)或(huo)通(tong)過(guo)15-20%丙(bing)烯酰(xian)胺(an)膠除去反(fan)應中(zhong)多余的(de)核苷酸(suan)，小(xiao)的寡(gua)核(he)苷酸(suan)，蛋(dan)白(bai)和(he)鹽離子(zi)。註(zhu)意：化學合成的RNA通常(chang)需要跑膠電(dian)泳(yong)純(chun)化（即(ji)PAGE膠純(chun)化）。
2.避(bi)免RNA酶(mei)汙染(ran)
微量(liang)的(de)RNA酶(mei)將導致siRNA實驗失敗(bai)。由於實驗環境(jing)中(zhong)RNA酶普(pu)遍存(cun)在，如皮膚(fu)，頭發(fa)，所有(you)徒手接觸(chu)過的(de)物品或暴(bao)露(lu)在空氣中(zhong)的物品等(deng)，此(ci)保證實驗每(mei)個(ge)步驟(zhou)不受(shou)RNA酶汙染(ran)非常(chang)重要。
3.健康(kang)的(de)細(xi)胞(bao)培養(yang)物和(he)嚴(yan)格(ge)的操(cao)作確保轉染(ran)的重復(fu)性
通常(chang)，健康(kang)的(de)細(xi)胞(bao)轉染(ran)效(xiao)率較高。此(ci)外，較低(di)的(de)傳(chuan)代數(shu)能確(que)保每(mei)次實驗所用細(xi)胞(bao)的穩定(ding)性。為(wei)了優(you)化實驗，推薦(jian)用50代(dai)以下的轉染(ran)細(xi)胞(bao)，否則細(xi)胞(bao)轉染(ran)效(xiao)率會(hui)隨(sui)時(shi)間(jian)明(ming)顯(xian)下降。
4.避(bi)免使用(yong)抗(kang)生素(su)
抗(kang)生素(su)會(hui)在穿透(tou)的(de)細(xi)胞(bao)中(zhong)積累毒素(su)。有(you)些細(xi)胞(bao)和(he)轉(zhuan)染(ran)試(shi)劑(ji)在siRNA轉染(ran)時(shi)需要無血清的條(tiao)件。這(zhe)種情(qing)況(kuang)下，可同時(shi)用正常(chang)培養(yang)基(ji)和(he)無血清培養(yang)基(ji)做對(dui)比實驗，以得(de)到(dao)最佳(jia)轉染(ran)效(xiao)果。
5.選(xuan)擇(ze)合適的轉(zhuan)染試(shi)劑(ji)
針對(dui)siRNA制(zhi)備(bei)方法(fa)以及靶細(xi)胞(bao)類型(xing)的不(bu)同，選(xuan)擇(ze)好的(de)轉染試(shi)劑(ji)和(he)優(you)化的(de)操(cao)作對(dui)siRNA實驗的成功至(zhi)關重要。
 6.通過(guo)合適的陽(yang)性對(dui)照優(you)化轉(zhuan)染和(he)檢測(ce)條(tiao)件
對(dui)大(da)多數(shu)細(xi)胞(bao)，看家(jia)基因(yin)是較好的(de)陽性(xing)對(dui)照。將(jiang)不(bu)同(tong)濃度的陽性(xing)對(dui)照的(de)siRNA轉(zhuan)入靶細(xi)胞(bao)（同樣(yang)適合實驗靶siRNA），轉染48小時(shi)後統(tong)計對(dui)照蛋(dan)白(bai)或mRNA相(xiang)對(dui)於未(wei)轉染細(xi)胞(bao)的降(jiang)低(di)水平。過多(duo)的(de)siRNA將導致(zhi)細(xi)胞(bao)毒性(xing)以至(zhi)死(si)亡。
7.通過標(biao)記(ji)siRNA來優(you)化實驗
熒(ying)光(guang)標(biao)記(ji)的siRNA能用(yong)來分(fen)析siRNA穩定(ding)性和(he)轉(zhuan)染(ran)效(xiao)率。標(biao)記(ji)的siRNA還可(ke)用(yong)作siRNA胞內(nei)定(ding)位及雙標(biao)記(ji)實驗（配合標(biao)記(ji)抗(kang)體）來追蹤(zong)轉染(ran)過(guo)程中(zhong)導入了(le)siRNA的細(xi)胞(bao)，將轉(zhuan)染與(yu)靶蛋白(bai)表達(da)的(de)下調結合起(qi)來。

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