SDS-PAGE 膠(jiao)染(ran)色(se)介(jie)紹

壹、各(ge)種(zhong)蛋(dan)白染(ran)色(se)方法的靈(ling)敏度(du)比較

二、考馬(ma)斯亮(liang)藍(lan)染(ran)色(se)

CBB 染(ran)色(se)液

0.5%考(kao)馬(ma)斯亮(liang)藍(lan) G250 或 R250

40%甲醇

10%乙酸(suan)

將 CBB 溶於(yu)甲醇中並(bing)不(bu)停的(de)攪(jiao)拌 15min。加(jia)入(ru)乙酸(suan)與(yu) ddH2O 脫色(se)液： 30%甲醇

10%乙酸(suan)

染(ran)色(se)方法： 1.在搖床上(shang)染(ran)色(se) 30min.

2.脫色(se)至蛋(dan)白點或條帶(dai)清(qing)晰可見

3. ddH2O 洗 3-5 次

三(san)、膠(jiao)體考(kao)馬(ma)氏(shi)亮(liang)藍(lan)染(ran) 色(se) Colloidal Coomassie Staining（ Cambridge centre for porteomics ）

sensitivity = ~100ng

1.  固(gu)定(ding)：甲醇/醋(cu)酸(suan)/H2 O(45:1:54) 至少(shao) 20min.

2.  染(ran)色(se) 12-18hr。

染(ran)色(se)液：   17% (w/v)  硫(liu)酸(suan)銨

34%甲醇

0.5%醋(cu)酸(suan)

0.1% (w/v) Coomassie G250

3.  脫色(se)：用 H2O 脫色(se)至蛋(dan)白點和背景清(qing)晰.

雙向(xiang)電泳蛋(dan)白點的切(qie)取和保(bao)存

1.   用 PDQuest 軟件(jian)或肉(rou)眼(yan)比對，找出感(gan)興(xing)趣的(de)蛋(dan)白點，並(bing)做好標記和記錄(lu)。

2.   用 MilliQ  水(shui)沖(chong)洗膠(jiao) 2 次。

3.   用色譜(pu)純甲醇和 MilliQ  水(shui)沖(chong)洗 Ep 管(guan)

4.   將槍頭(tou)(200µl)下(xia)端(duan)剪(jian)去，使(shi)其內徑略小於蛋(dan)白斑點的直徑(jing)，用色譜(pu)純甲醇和 MilliQ 水(shui)沖(chong)洗槍頭(tou)。

5.   對(dui)準斑(ban)點中央(yang)小心(xin)將蛋(dan)白切(qie)割下(xia)來(lai)， 放(fang)入(ru) Ep 管(guan)，MilliQ 水(shui)漂洗 2 次， 如膠(jiao)塊 太(tai)大(da)，將其切(qie)成 1 x 1 mm 的膠(jiao)片(pian)。

6.   將切(qie)好的點做好標記和記錄(lu)，置(zhi)-80oC 保(bao)存(cun)或凍幹後(hou)-20oC 存放(fang)。

註(zhu)意事項：

1.   盡量(liang)避(bi)免(mian)皮(pi)膚(fu)和頭(tou)發(fa)的角蛋(dan)白的汙染(ran)，在(zai)操(cao)作過程中應(ying)戴(dai)壹次性(xing)的(de) PE 手(shou)套(tao) （不(bu)用乳(ru)膠(jiao)手(shou)套(tao)）和帽(mao)子。

2.   不(bu)要(yao)將膠(jiao)長期(qi)存(cun)放(fang)於(yu)乙酸(suan)溶液中。

3.   Ep 管(guan)及染(ran)膠(jiao)的容(rong)器(qi)必須用甲醇和水(shui)充分(fen)清洗(xi)， 尤其(qi)應(ying)與(yu)進行(xing) Western blotting 的容(rong)器(qi)分開(kai)，以避(bi)免(mian) casein 或 BSA 的(de)汙(wu)染(ran)。