雙(shuang)向電泳的(de)樣(yang)品的(de)制備及電泳實(shi)驗(yan)步(bu)驟

樣(yang)品制備原則

樣(yang)品制備是雙(shuang)向(xiang)電泳中(zhong)最(zui)關(guan)鍵(jian)的(de)壹步(bu)，將(jiang)直(zhi)接影響 2-DE 結(jie)果好壞(huai)。目(mu)前(qian)並 沒(mei)有壹個(ge)通用(yong)的(de)樣(yang)品制備方法， 盡(jin)管(guan)處(chu)理方法多(duo)種(zhong)多(duo)樣(yang)， 但(dan)都遵(zun)循(xun)幾個(ge)基本(ben)的(de)原(yuan) 則： 1）盡(jin)可能的(de)提(ti)高樣(yang)品蛋白的(de)溶解(jie)度，抽(chou)提最(zui)大(da)量(liang)的(de)總(zong)蛋白，減(jian)少(shao)蛋白質(zhi)的 損失(shi)； 2）減(jian)少(shao)對蛋白質(zhi)的人(ren)為修(xiu)飾(shi)； 3）破壞(huai)蛋白質(zhi)與(yu)其(qi)他(ta)生(sheng)物大(da)分子(zi)的(de)相(xiang)互(hu)作

用(yong)，並(bing)使(shi)蛋白質(zhi)處(chu)於(yu)變性(xing)狀(zhuang)態。

根據(ju)這(zhe)壹原(yuan)則，樣(yang)品制備需(xu)要(yao)四(si)種(zhong)主要(yao)的試(shi)劑(ji)：離液(ye)劑(ji)(chaotropes), 主要(yao)包(bao) 括(kuo)尿素（Urea）和硫(liu)脲(niao)（thiourea ）；表面活性劑(ji)（sufactants），也稱(cheng)去(qu)垢劑(ji)，

如 CHAPS 與(yu) Zwittergent 系列(lie)等(deng)雙(shuang)性(xing)離子(zi)去(qu)垢劑(ji)；還(hai)原劑(ji)（reducing agents），常(chang)用(yong)的(de)是(shi)二硫蘇糖醇（DTT）和磷(lin)酸(suan)三丁(ding)酯（TBP）等(deng)。當然(ran)，也可以選擇性 的(de)加入 Tris-base, 蛋白酶(mei)抑制劑(ji)以及核酸(suan)酶(mei)。樣(yang)品的(de)來(lai)源(yuan)不(bu)同(tong)，其(qi)裂解(jie)的緩(huan)沖(chong)液(ye)也各(ge)不(bu)相同(tong)。通過(guo)不同(tong)試(shi)劑(ji)的合理組合， 以(yi)達到(dao)對(dui)樣(yang)品蛋白的(de)最(zui)大(da)抽(chou)提。在(zai)對樣(yang)品蛋白質(zhi)提取(qu)的過(guo)程(cheng)中(zhong)， 必(bi)須(xu)考(kao)慮到(dao)去(qu)除 影響蛋白質(zhi)可溶性和(he) 2DE 重(zhong)復(fu)性(xing)的物質(zhi)，比(bi)如(ru)核(he)酸、脂、多(duo)糖等(deng)大(da)分子(zi)以(yi)及鹽  類(lei)小(xiao)分子(zi)。大(da)分子(zi)的(de)存(cun)在(zai)會(hui)阻(zu)塞凝膠孔(kong)徑(jing)，鹽濃(nong)度過(guo)高會(hui)降(jiang)低等(deng)電聚焦(jiao)的(de)電壓(ya)， 甚(shen)至會(hui)損壞(huai) IPG 膠條，這(zhe)樣(yang)都會(hui)造成(cheng) 2-DE 的(de)失(shi)敗(bai)。樣(yang)品制備的失(shi)敗(bai)很難(nan)通過(guo)後

續工作的(de)完(wan)善(shan)或改進(jin)獲(huo)得(de)補償。

核酸(suan)的去(qu)除可采(cai)用(yong)超(chao)聲(sheng)或(huo)核酸酶處(chu)理， 超(chao)聲(sheng)處(chu)理應控制好條件(jian)， 並(bing)防止產(chan)生(sheng) 泡沫； 而(er)加入的外(wai)源核酸(suan)酶(mei)則會(hui)出(chu)現在(zai)最(zui)終的(de) 2D 膠上(shang)。脂類和(he)多(duo)糖都可以通過(guo) 超(chao)速(su)離心除去(qu)。透析(xi)可以降低鹽濃度(du)， 但(dan)時(shi)間(jian)太(tai)長； 也(ye)可以采(cai)取(qu)凝膠過(guo)濾(lv)或沈(chen)澱 /重(zhong)懸法脫(tuo)鹽(yan)，但(dan)會(hui)造成(cheng)蛋白質(zhi)的部分損失(shi)。

因(yin)此(ci)， 樣(yang)品制備方法必(bi)須(xu)根據(ju)不(bu)同(tong)的樣(yang)品、所(suo)處(chu)的(de)狀(zhuang)態以及實驗(yan)目(mu)的和(he)要求(qiu) 來(lai)進(jin)行選擇。 目前(qian)有很多(duo)方法適(shi)於 2-DE，如組織(zhi)或細(xi)胞(bao)的(de)總(zong)蛋白提(ti)取物、亞(ya)細(xi) 胞(bao)組份或細胞(bao)器蛋白、免疫(yi)沈(chen)澱的蛋白及其(qi)它亞組份蛋白（如(ru)磷酸(suan)化(hua)蛋白、 采(cai)用(yong) 親合純(chun)化(hua)凝集(ji)素結(jie)合蛋白等(deng)）。

壹、細(xi)胞(bao)樣(yang)品

1.    細(xi)胞(bao)培養(yang)，加藥與(yu)處(chu)理。

2.    胰酶(mei)消化(hua)貼壁(bi)細胞， PBS 漂(piao)洗(xi) 3 次(1500g, 5min) ，棄上(shang)清,  再次離心，去(qu) 盡殘(can)液(ye)（ 非常(chang)重(zhong)要(yao)！）。如(ru)要比(bi)較細胞(bao)膜(mo)蛋白組的差別(bie)， 最(zui)好(hao)用(yong)細(xi)胞(bao)刮(gua)收獲(huo)細 胞。如(ru)用(yong) 10mM Tris/ 250 mM Sucrose(pH 7.0)代(dai)替 PBS，可有效(xiao)降(jiang)低樣(yang)品的(de) 鹽(yan)濃度(du)。加入 5 倍體(ti)積(ji)裂解(jie)液(ye)，混勻（或(huo)將(jiang) 1× 106  細(xi)胞(bao)懸於 60 ～ 100µl 裂解(jie)液(ye) 中(zhong) ）。 

3.    加 50ug/ml RNase 及 200ug/ml Dnase ，在(zai) 4℃放置 15 分鐘。

4.    15,000 轉， 4℃離心 60 分鐘（或 40,000 轉(zhuan)， 4℃離心 30 分鐘 ）。 

5.    收集(ji)上清。

6.    測定(ding)蛋白濃(nong)度(采(cai)用(yong) BioRad RC/DC protein assay kit)。

7.    分裝(zhuang)樣(yang)品，凍(dong)存於(yu)－70℃。

二、組織(zhi)樣(yang)品

1.   碾(nian)缽(bo)碾(nian)磨(mo)組織(zhi)，碾(nian)至(zhi)粉末狀(zhuang)。

2.   將(jiang)適(shi)量(liang)粉(fen)末狀(zhuang)組織(zhi)轉移(yi)至勻漿(jiang)器，加入適量(liang)裂解(jie)液(ye)，進(jin)行勻漿(jiang)。

3.   加 50ug/ml RNase 及 200ug/ml DNase，在(zai) 4℃放置 15 分鐘。

4.   15,000 轉， 4℃離心 60 分鐘（或 40,000 轉(zhuan)， 4℃離心 30 分鐘 ）。 

5.   收集(ji)上清，測定(ding)蛋白濃(nong)度。

6.    分裝(zhuang)樣(yang)品，凍(dong)存於(yu)－70℃。

註意事(shi)項：

1.   8 mmol/L PMSF 必(bi)須(xu)在(zai)添(tian)加還(hai)原劑(ji)之前(qian)用(yong)，否(fou)則(則) PMSF 會(hui)失(shi)去(qu)活性。 

2.  40 mmol/L 濃(nong)度(du)以下的(de) Tris 可使(shi)有些(xie)蛋白酶(mei)在(zai)高 pH 值(zhi)下(xia)失(shi)活。

3.   細胞(bao)清洗―― 大多(duo)用(yong) PBS，若(ruo) PBS 殘(can)留(liu)於(yu)細胞表面(mian)會(hui)造成(cheng)膠上(shang)出(chu)現水(shui)平條紋(wen) ，

則可利(li)用(yong)(10 mmol/LTris, 250 mmol/L sucrose pH 7.0)來(來)解(jie)決此(ci)問題。 

雙(shuang)向(xiang)電泳操(cao)作(zuo)步(bu)驟

水(shui)化(hua)上樣(yang)(被(bei)動上樣(yang))

1.    從(cong)冰(bing)箱(xiang)中(zhong)取(qu)出(chu) IPG 膠條，室溫(wen)放置 10min。

2.    沿(yan)水(shui)化(hua)盤(pan)槽(cao)的邊緣(yuan)從(cong)左(zuo)向(xiang)右(you)線性加入樣(yang)品，槽(cao)兩(liang)端各(ge) 1cm 左(zuo)右不加樣(yang)，中(zhong)間(jian) 的樣(yang)品液(ye)壹定(ding)要(yao)連(lian)貫(guan).註(zhu)意(yi)：不要產(chan)生(sheng)氣(qi)泡(pao)， 否(fou)則會(hui)影響膠條中(zhong)蛋白質(zhi)的分布(bu)。

3.    用(yong)鑷子(zi)輕(qing)輕(qing)撕(si)去(qu) IPG 膠條上的(de)保護(hu)層。 註意(yi)：堿(jian)性(xing)端(duan)較脆(cui)弱(ruo)，應小心操(cao)作(zuo)。

4.    將(jiang)IPG 膠條膠面(mian)朝(chao)下(xia)輕(qing)輕(qing)置於(yu)水(shui)化(hua)盤(pan)中(zhong)樣(yang)品溶液(ye)上.註意:不要(yao)將(jiang)樣(yang)品溶液(ye)弄到(dao) 膠條背面(mian), 因為(wei)這(zhe)些(xie)溶液(ye)不會(hui)被(bei)膠條吸收;還(hai)使(shi)膠條下面(mian)的溶液(ye)產(chan)生(sheng)氣(qi)泡(pao)。如(ru)產(chan) 生(sheng)了(le)氣(qi)泡(pao)，用(yong)鑷子(zi)輕(qing)輕(qing)地提起膠條的壹端(duan)，上(shang)下移(yi)動膠條，直到(dao)氣(qi)泡(pao)被(bei)趕(gan)走。

5.    放置 30~45min 大(da)部分樣(yang)品被(bei)膠條吸收， 沿(yan)著膠條緩慢(man)加入礦物油(you)， 每根膠條

約 3ml(17cm IPG)，防止膠條水(shui)化(hua)過(guo)程(cheng)中(zhong)液(ye)體(ti)蒸發。

6.    置等(deng)電聚焦(jiao)儀於(yu)-20℃水(shui)化(hua) 11~15h。

壹向(xiang) 等(deng)電聚焦(jiao)

1.    將(jiang)紙(zhi)電極置於(yu)聚(ju)焦(jiao)盤(pan)的(de)正負極(ji)上，加 ddH2O 5~8µl 潤(run)濕(shi)。

2.    取出(chu)水(shui)化(hua)好的(de)膠條，提起壹端(duan)將(jiang)礦(kuang)物油(you)瀝(li)幹(gan)，膠面(mian)朝(chao)下(xia)，將(jiang)其(qi)置於(yu)剛(gang)好潤(run)濕(shi) 的濾(lv)紙片上(shang)雜(za)交以(yi)去(qu)除表面(mian)上(shang)的(de)不溶物。

3.    將(jiang) IPG 膠條膠面(mian)朝(chao)下(xia)置於(yu)聚(ju)焦(jiao)盤(pan)中(zhong)， 膠條的正極（標有+ ）對(dui)應於聚焦(jiao)盤(pan)的(de)正極，確保膠條與(yu)電極緊密(mi)接觸(chu)。

4.    在(zai)每根膠條上覆蓋(gai) 2-3ml 礦(kuang)物油(you)。

5.    對(dui)好(hao)正、負極(ji)，蓋(gai)上(shang)蓋(gai)子(zi)。設置等(deng)電聚焦(jiao)程(cheng)序(xu)。

6.    聚焦(jiao)結(jie)束的膠條，立即(ji)進(jin)行平衡、第二向 SDS-PAGE 電泳。或(huo)將(jiang)膠條置於(yu)樣(yang)

品水(shui)化(hua)盤(pan)中(zhong)， -20℃冰(bing)箱(xiang)保存(cun)， 電泳前(qian)取出(chu)膠條， 室溫(wen)放置 10 分鐘， 使(shi)其(qi)溶解(jie)。

第二向 SDS-PAGE 電泳

1.    配(pei)制 12%的丙烯酰(xian)胺(an)凝膠。

2.    待(dai)凝膠凝固後， 倒(dao)去(qu)分離膠表(biao)面的 MilliQ  水(shui)、乙(yi)醇或水(shui)飽(bao)和(he)正丁醇， 用(yong)MilliQ 水(shui)沖(chong)洗。

3.    配(pei)制膠條平衡緩沖(chong)液(ye) I

4.    在(zai)桌上(shang)先(xian)放置幹(gan)的(de)厚濾(lv)紙， 聚(ju)焦(jiao)好(hao)的膠條膠面(mian)朝(chao)上(shang)放在(zai)幹的(de)厚濾(lv)紙上(shang)。將(jiang)另(ling) 壹份(fen)厚(hou)濾(lv)紙用(yong) MilliQ 水(shui)浸(jin)濕(shi)，擠去(qu)多(duo)余水(shui)分，然(ran)後直(zhi)接置於(yu)膠條上，輕(qing)輕(qing)吸 幹膠條上的(de)礦物油(you)及多(duo)余樣(yang)品，這(zhe)樣(yang)可以減(jian)少(shao)凝膠染(ran)色時出(chu)現的(de)縱(zong)條紋(wen)。

5.    將(jiang)膠條轉移(yi)至樣(yang)品水(shui)化(hua)盤(pan)中(zhong)，加入 6ml(17cm IPG)平衡緩沖(chong)液(ye) I，在(zai)水(shui)平搖(yao)床 上(shang)緩慢(man)搖(yao)晃 15 分鐘。

6.    配制膠條平衡緩沖(chong)液(ye) II。

7.    第壹次平衡結(jie)束後，取(qu)出(chu)膠條將(jiang)之(zhi)豎(shu)在(zai)濾(lv)紙上(shang)瀝去(qu)多(duo)余的(de)液(ye)體(ti)，放入平衡緩 沖(chong)液(ye) II 中(zhong)，繼(ji)續在(zai)水(shui)平搖(yao)床上(shang)緩慢(man)搖(yao)晃 15 分鐘。

8.    用(yong)濾(lv)紙吸去(qu) SDS-PAGE 膠上(shang)方玻(bo)璃板(ban)間(jian)多(duo)余的(de)液(ye)體(ti)， 將(jiang)二向凝膠放在(zai)桌面(mian)上(shang)，

凝膠的(de)頂部面(mian)對(dui)自(zi)己(ji)。

9.    將(jiang)瓊(qiong)脂(zhi)糖封(feng)膠液(ye)加熱(re)溶解(jie)。

10.  在(zai) 100ml 量筒中(zhong)加入 TGS 電泳緩(huan)沖(chong)液(ye)。

11.  第二次平衡結(jie)束後，取(qu)出(chu)膠條，用(yong)濾(lv)紙吸去(qu)多(duo)余的(de)平衡液(ye)（將(jiang)膠條豎在(zai)濾(lv)紙 上(shang)，以免損失(shi)蛋白或(huo)損壞(huai)凝膠表(biao)面）。

12.  用(yong)鑷子(zi)夾(jia)住(zhu)膠條的壹端(duan)使(shi)膠面(mian)全浸末在(zai) 1× 電泳緩(huan)沖(chong)液(ye)中(zhong)漂(piao)洗(xi)數次。

13.  將(jiang)膠條背面(mian)朝(chao)向(xiang)玻(bo)璃板(ban)，輕(qing)輕(qing)放在(zai)長玻(bo)板(ban)上，加入低熔點(dian)瓊(qiong)脂(zhi)糖封(feng)膠液(ye)。

14.  用(yong)適(shi)當厚(hou)度的(de)膠片, 輕(qing)輕(qing)地將(jiang)膠條向下(xia)推,使(shi)之(zhi)與(yu)聚丙(bing)烯(xi)酰(xian)胺(an)凝膠膠面(mian)全接 觸(chu).註意(yi):不(bu)要(yao)在(zai)膠條下方(fang)產(chan)生(sheng)氣(qi)泡(pao)， 應推動凝膠背(bei)面的支撐(cheng)膜(mo)， 不要(yao)碰到(dao)膠面(mian)。

15.  放置 5 分鐘，使(shi)低熔點(dian)瓊(qiong)脂(zhi)糖封(feng)膠液(ye)凝固。

16.  打(da)開(kai)二向電泳制冷儀，調(tiao)溫度(du)為 15℃。

17.  將(jiang)凝膠轉(zhuan)移(yi)至電泳槽(cao)中(zhong)，加入電泳緩(huan)沖(chong)液(ye)，接通(tong)電源，起始時用(yong)的(de)低電流(liu) （5mA~10mA/gel/17cm ），待(dai)樣(yang)品在(zai)全走(zou)出(chu) IPG 膠條， 濃縮(suo)成(cheng)壹條線後， 再 加 大 電流(liu)（20-30mA/gel/17cm ）待(dai)溴(xiu)酚(fen)藍指(zhi)示劑(ji)達到(dao)底(di)部邊緣(yuan)時即(ji)可停(ting)止電泳。

 18.  電泳結(jie)束後，輕(qing)輕(qing)撬開(kai)兩(liang)層玻(bo)璃，取(qu)出(chu)凝膠，並(bing)切(qie)角以作(zuo)記號(hao)（戴手套，防止汙(wu)染膠面(mian)）。

19.  進(jin)行染(ran)色。

更(geng)多(duo)實驗(yan)室(shi)儀器、實驗(yan)室(shi)設備、實驗(yan)耗(hao)材(cai)進(jin)入(ru)蘇(su)州阿(e)爾法生(sheng)物實(shi)驗(yan)器材(cai)有限(xian)公司進(jin)行了(le)解(jie)。