質粒基因(yin)組(zu)提(ti)取(qu)實驗(yan)步(bu)驟

DNA提(ti)取(qu)是(shi)生(sheng)物(wu)學實驗(yan)中(zhong)常見的實驗(yan)步(bu)驟，用(yong)於分(fen)離(li)和(he)純(chun)化(hua)DNA以進行(xing)後續實驗(yan)分(fen)析(xi)。本(ben)文(wen)將(jiang)介(jie)紹使(shi)用(yong)天根(gen)質粒 DNA 提(ti)取(qu)試(shi)劑盒進行(xing)質粒基因(yin)提(ti)取(qu)的實驗(yan)步(bu)驟。該(gai)試(shi)劑盒使(shi)用(yong)堿(jian)裂解法(fa)提(ti)取(qu)質粒DNA ，具有(you)簡(jian)便(bian)快(kuai)速(su)、高(gao)效(xiao)純(chun)化(hua)的特(te)點。

    實驗(yan)步(bu)驟如下(xia)：

壹(yi)、培(pei)養細菌並(bing)制備含有(you)質粒的細胞懸(xuan)液：

1. 從(cong)平(ping)板(ban)上挑(tiao)取(qu)單(dan)克(ke)隆(long)細(xi)菌，轉(zhuan)入(ru)含有(you)3mL LB+Amp100培(pei)養基的試(shi)管中(zhong)。使(shi)用(yong)含有(you)抗(kang)生素(su)氨芐(bian)青(qing)黴素(su)的LB 培(pei)養基可以選(xuan)擇(ze)性(xing)地培(pei)養含有(you)質粒的細菌(jun)群(qun)體。

2. 在(zai)37℃的恒溫(wen)搖(yao)床上振(zhen)蕩(dang)培(pei)養過夜(ye)，以促進細(xi)菌生(sheng)長(chang)並(bing)擴增質粒。

二、收(shou)集(ji)和(he)裂(lie)解細(xi)胞，分(fen)離(li)並(bing)純(chun)化(hua)質粒DNA：

3. 將(jiang)培(pei)養液倒(dao)入1.5 mL微(wei)量離(li)心管中(zhong)，以4000 r/min離(li)心 2 min，使(shi)細菌(jun)沈(chen)澱(dian)。

4. 倒(dao)出(chu)培(pei)養液，使(shi)細胞沈(chen)澱(dian)盡可能幹燥。

5. 加入(ru)100 μL溶(rong)液Ⅰ（ 50 mmol/L葡萄(tao)糖，25mmol/LTris (pH 8.0)，10 mmol/L EDTA （ pH 8.0）），充(chong)分(fen)振(zhen)蕩(dang)混勻，室(shi)溫(wen)放(fang)置5 min。

6. 加入(ru)200 μL溶(rong)液Ⅱ（ 0.2 mol/L NaOH，1% SDS），蓋(gai)緊管(guan)口(kou)，顛倒(dao)混勻內(nei)容物(wu)，將(jiang)離(li)心管放(fang)置冰(bing)上5 min 。

7. 加入(ru)150 μL溶(rong)液Ⅲ（ 5 mol/L乙酸鉀(jia)），蓋緊管(guan)口(kou)，顛倒(dao)數次使(shi)混勻。冰(bing)上放(fang)置5 min。

8. 以12000 r/min離(li)心15 min，將(jiang)上(shang)清(qing)轉(zhuan)至(zhi)另(ling)壹(yi)離心管中(zhong)。

9. 可(ke)選(xuan)擇(ze)性(xing)地加入(ru)等(deng)體積(ji)氯(lv)仿(fang)/異(yi)戊醇（24:1）進行(xing)去蛋白(bai)處理(li)，使(shi) DNA與蛋(dan)白(bai)質分(fen)離(li)。反(fan)復(fu)混勻後，以10000 r/min離(li)心10 min，將(jiang)上(shang)清(qing)轉(zhuan)移(yi)到(dao)另(ling)壹(yi)離心管中(zhong)。該(gai)步(bu)驟可以根(gen)據(ju)實驗(yan)需(xu)求(qiu)選(xuan)擇(ze)性(xing)地進行(xing)。

10. 向(xiang)上清(qing)中加入(ru)2倍(bei)體積(ji)的乙醇(chun)（約700μ L），混勻後，室溫放(fang)置15-30min。以10000 r/min離(li)心 10 min 。倒(dao)去上清(qing)液，將(jiang)離(li)心管倒(dao)扣(kou)在(zai)吸水紙(zhi)上，吸幹液體。

11. 用(yong)500 μL 70% 乙醇(chun)輕輕洗滌質粒 DNA沈(chen)澱(dian)，以10000 r/min離(li)心5min，棄(qi)去上清(qing)液，並使(shi)沈(chen)澱(dian)幹燥。

12. 加入(ru)適(shi)量（20-50 μL）的無菌水(shui)，室溫(wen)使(shi) DNA全(quan)溶(rong)解，然後將(jiang)溶(rong)解的DNA在(zai)-20℃保(bao)存(cun)。

    實驗(yan)中(zhong)，天根質粒DNA提(ti)取(qu)試(shi)劑盒提(ti)供了(le)各(ge)種(zhong)試(shi)劑和緩(huan)沖液，方(fang)便(bian)實驗(yan)操作(zuo)和(he)質粒 DNA的提(ti)取(qu)。這些試(shi)劑的配方(fang)經(jing)過(guo)優(you)化(hua)和驗證，確(que)保提(ti)取(qu)的質粒 DNA質量好、純(chun)度(du)高(gao)。

    註意事(shi)項(xiang)：

    1. 溶(rong)液Ⅱ需(xu)要(yao)新(xin)鮮(xian)配(pei)制，以確(que)保高(gao)效(xiao)的細胞裂(lie)解和(he)DNA解鏈(lian)。

    2. 加入(ru)溶(rong)液Ⅱ後不要劇(ju)烈(lie)震(zhen)蕩(dang)，以免(mian)影(ying)響(xiang)DNA質量。

    3. 沈(chen)澱(dian)DNA通(tong)常使(shi)用(yong)冰(bing)冷的乙醇(chun)，加入(ru)後放(fang)置時(shi)間稍長(chang)可(ke)使(shi)DNA 沈(chen)澱(dian)全(quan)，並可(ke)用(yong)異丙(bing)醇(chun)代(dai)替乙醇(chun)，但(dan)需(xu)註意異丙醇(chun)會(hui)將(jiang)鹽(yan)沈(chen)澱(dian)下來。

    4. 在(zai)DNA溶(rong)解過(guo)程(cheng)中，溫(wen)度(du)要嚴格控制，避(bi)免(mian)過(guo)高(gao)的溫度(du)導致DNA 降解。

天(tian)根質粒DNA提(ti)取(qu)試(shi)劑盒提(ti)供了(le)方(fang)便(bian)、快(kuai)速(su)、高(gao)純(chun)度(du)的質粒DNA提(ti)取(qu)方(fang)法(fa)。根(gen)據(ju)實驗(yan)步(bu)驟操作(zuo)，可(ke)以有(you)效(xiao)提(ti)取(qu)並(bing)純(chun)化(hua)質粒 DNA。該(gai)方(fang)法(fa)適(shi)用(yong)於大(da)量(liang)轉(zhuan)化(hua)子(zi)中(zhong)制備少(shao)量(liang)部(bu)分(fen)純(chun)化(hua)的質粒DNA，滿足(zu)後續實驗(yan)的需(xu)求(qiu)。

蘇州阿(e)爾法(fa)生物(wu)提(ti)供的實驗(yan)試(shi)劑主要(yao)有(you)：

1.細(xi)胞類(lei)產品：

各(ge)種(zhong)的腫(zhong)瘤(liu)細胞、基(ji)因編輯(ji)細(xi)胞：比(bi)如常見的HEK293細(xi)胞、CHO細(xi)胞、骨髓(sui)幹細胞、胚(pei)胎(tai)2. 天(tian)根試(shi)劑盒產(chan)品：天根系(xi)列(lie)試(shi)劑盒主(zhu)要有(you)質粒大提(ti)、質粒小提(ti)等(deng)各(ge)種(zhong)質粒抽提(ti)試(shi)劑盒、血(xue)液DNA提(ti)取(qu)試(shi)劑盒、細(xi)菌DNA提(ti)取(qu)試(shi)劑盒、病(bing)毒 RNA 提(ti)取(qu)試(shi)劑盒、天(tian)根質粒DNA提(ti)取(qu)試(shi)劑盒、 植(zhi)物(wu)組織(zhi)DNA提(ti)取(qu)試(shi)劑盒等(deng)各(ge)種(zhong)基(ji)因(yin)組(zu)提(ti)取(qu)試(shi)劑盒。還(hai)有(you) DH5&/TOP--10感受態等(deng)。

3.  其他試(shi)劑類：細(xi)胞培(pei)養試(shi)劑、分(fen)子(zi)生(sheng)物(wu)學試(shi)劑、緩(huan)沖液、培(pei)養基、抗(kang)體、碧(bi)雲(yun)天試(shi)劑等(deng)。