CRISPR/Cas9 基因(yin)編輯和NGS驗(yan)證(zheng)

CRISPR/Cas9 基因(yin)編輯技(ji)術(shu)需要(yao)通過下壹代(dai)測序 (NGS) 來(lai)驗證(zheng)，能(neng)夠(gou)在(zai)核苷(gan)酸水(shui)平分(fen)辨(bian)率(lv)下進行大(da)規(gui)模評估基因(yin)編輯的(de)準確(que)性(xing)和可(ke)靠性(xing)。高(gao)效、可(ke)自動化(hua)和可(ke)擴展的 CIRCLE-seq 是壹種(zhong)體(ti)外(wai) NGS 測定(ding)，可(ke)以對(dui) CRISPR 介導的(de)切(qie)割(ge)進(jin)行靈(ling)敏的脫(tuo)靶(ba)檢測。

CRISPR/Cas9 基因(yin)編輯技(ji)術(shu)

CRISPR 代表(biao)成簇規律間(jian)隔的短(duan)回(hui)文重(zhong)復序列(lie)。這(zhe)些(xie)重(zhong)復的 DNA 片段最初來(lai)源(yuan)於病毒(du)病原體(ti)，並作為(wei)模板(ban)將(jiang) CRISPR 相(xiang)關蛋白 9 (Cas9) 核酸內切(qie)酶(mei)引(yin)導至(zhi)新(xin)入(ru)侵(qin)的(de)病(bing)毒(du)。當 Cas9 遇到(dao)同(tong)源(yuan)病毒(du)序列(lie)時，它(ta)會(hui)產生(sheng)近(jin)端(duan)雙(shuang)鏈(lian)斷裂 (DSB)。類(lei)似地，當 Cas9 和指(zhi)導 RNA (gRNA) 被(bei)轉(zhuan)染(ran)到哺乳動物(wu)細胞中(zhong)時，接(jie)近(jin) gRNA 的(de)同(tong)源(yuan)序列(lie)被(bei)切割(ge)。然後(hou)通過內源(yuan)性(xing)易(yi)出(chu)錯的非同(tong)源(yuan)末端(duan)連接 (NHEJ) 過程將(jiang)末端(duan)重(zhong)新連(lian)接(jie)在(zai)壹起，或(huo)使(shi)用外源(yuan)提供的(de)供體(ti)（修(xiu)復）模板(ban)通(tong)過同(tong)源(yuan)定(ding)向(xiang)修復 (HDR) 進行(xing)修(xiu)補，從而修復 DSB。

研究(jiu)人(ren)員使(shi)用 HDR 以已(yi)知且可(ke)預(yu)測的(de)方式(shi)改(gai)變基因(yin)序(xu)列(lie)。gRNA 決(jue)定(ding)編輯將(jiang)在(zai)何處進行(xing)，而供體(ti)模(mo)板 DNA（其(qi)末端(duan)與 DSB 站點(dian)共(gong)享同(tong)源(yuan)性(xing)）決(jue)定(ding)編輯的(de)外(wai)觀(guan)。

由於這(zhe)些(xie)是關鍵組(zu)件(jian)，因(yin)此確(que)保 gRNA 和修(xiu)復模板(ban)沒(mei)有錯誤非常(chang)重(zhong)要。使(shi)用KAPA HiFi高(gao)保真(zhen)DNA聚(ju)合(he)酶(mei)等優質試劑(ji)進行(xing)擴(kuo)增有助(zhu)於(yu)確(que)保準確(que)性(xing)和特異(yi)性(xing)。

NGS 驗證(zheng)法(fa)

即使(shi)使(shi)用的聚(ju)合(he)酶(mei)為(wei) CRISPR HDR 生(sheng)成(cheng)準確(que)的(de)修(xiu)復模板(ban)，實(shi)驗室也(ye)需要(yao)壹種(zhong)方法(fa)來(lai)驗證(zheng)基因(yin)編輯是否(fou)成(cheng)功(gong)——編輯的(de)位點(dian)包含預(yu)期的(de)序列(lie)。NGS 提供了(le)壹種(zhong)高(gao)通(tong)量(liang)、自(zi)動化(hua)友(you)好的(de)方法(fa)來(lai)驗證(zheng)克隆(long)分(fen)離(li)物(wu)中(zhong)的(de)目標(biao)基因(yin)編輯。

為(wei)了(le)從 NGS 中(zhong)獲(huo)得好的結(jie)果(guo)，強(qiang)大(da)的(de)文庫(ku)制(zhi)備是少不了(le)的。Dana-Farber 癌(ai)癥研(yan)究所的分(fen)子(zi)生(sheng)物(wu)學核心(xin)設(she)施(shi) (MBCF) 發(fa)現(xian) KAPA HyperPrep 試劑(ji)盒(he)提供的(de)工作流程(cheng)能(neng)夠(gou)適(shi)應各(ge)種(zhong)擴(kuo)增(zeng)子(zi)輸入(ru)量(liang)和大(da)小(xiao)，從而最大(da)限(xian)度地減(jian)少輸入(ru) QC 和特定(ding)樣(yang)本工作流程(cheng)修改(gai)的需(xu)要. 使(shi)工作流程(cheng)適應他(ta)們的自(zi)動液體(ti)處理系統，允(yun)許(xu)在(zai)大(da)約(yue) 3-1/2 小時的(de)儀(yi)器(qi)時間(jian)內(nei)基於(yu)擴(kuo)增子(zi)的文庫(ku)制(zhi)備 96 個克(ke)隆(long)樣(yang)本。

CRISPR的切(qie)割(ge)位點(dian)的(de)優(you)化(hua)

驗(yan)證(zheng)預(yu)期的(de)位點(dian)是否(fou)已(yi)成(cheng)功(gong)修改(gai)是壹回(hui)事，但(dan)無論(lun)計算機設計多麽強(qiang)，基於(yu) CRISPR/Cas9 的(de)基因(yin)編輯中(zhong)使(shi)用的 Cas9 核(he)酸酶(mei)都有(you)可(ke)能(neng)以類似的方式(shi)切(qie)割(ge)和改(gai)變非預(yu)期的(de)目標(biao)序列(lie)。因(yin)此，實驗(yan)室需(xu)要壹種(zhong)方法(fa)來(lai)識(shi)別(bie)可(ke)能(neng)的(de)脫靶(ba)切(qie)割(ge)位點(dian)，並能(neng)夠(gou)將(jiang)這(zhe)些(xie)位點(dian)與(yu)擴(kuo)增(zeng)導致(zhi)的(de)簡(jian)單錯誤區分(fen)開(kai)來(lai)。有幾(ji)種 NGS 工(gong)作流程(cheng)可(ke)以實現(xian)這(zhe)壹點(dian)。

例(li)如，Digenome-seq 是壹種(zhong)相(xiang)對(dui)簡單的體(ti)外(wai)檢測(ce)方法(fa)，其中(zhong)使(shi)用 Cas9 核酸(suan)酶切(qie)割(ge)從(cong)目標(biao)細胞中(zhong)提取的(de)基因(yin)組(zu) DNA，將(jiang) NGS 測(ce)序(xu)接(jie)頭連接到(dao)所有(you)遊(you)離端(duan)，並對(dui)生(sheng)成(cheng)的(de)文庫(ku)進(jin)行(xing)測(ce)序(xu)以鑒(jian)定(ding)削(xue)減。然而，由於文庫(ku)沒(mei)有(you)針(zhen)對(dui)切割(ge)位點(dian)進(jin)行(xing)富(fu)集(ji)，因此未修(xiu)飾(shi) DNA 的(de)背景(jing)很(hen)高(gao)，需(xu)要(yao)大(da)量(liang)的測序(xu)讀(du)數(shu)，並且很難找(zhao)到(dao)罕見的切割(ge)事(shi)件(jian)。

CRISPR/Cas9基因(yin)編輯技(ji)術(shu)
GUIDE-seq 方法(fa)

通過先在(zai)體(ti)內(nei)富集(ji)摻(chan)入(ru) Cas9 引(yin)入(ru)的(de) DSB 中(zhong)的(de)寡(gua)核苷(gan)酸來(lai)降(jiang)低(di)測序成(cheng)本。但(dan)它(ta)的(de)靈(ling)敏度較(jiao)低(di)，並且作為(wei)壹種(zhong)基於(yu)細胞的(de)檢(jian)測方法(fa)，它(ta)既(ji)費時又費力(li)，而且僅限於易(yi)於轉(zhuan)染(ran)的細胞。

CIRCLE-seq 代(dai)表(biao) Circularization for In vitro Reporting of Cleaveage Effects by SEQuencing，它(ta)結(jie)合(he)了(le)靈(ling)活(huo)的體(ti)外(wai)工作流程(cheng)和僅(jin)選擇性(xing)測序(xu) Cas9 切割(ge)的(de) DNA 的所有(you)富集(ji)優勢(shi)。1 隨機剪切(qie)的(de)基因(yin)組(zu) DNA 被環(huan)化(hua)，然後(hou)用 Cas9 切割(ge). 只有(you)具(ju)有切(qie)割(ge)位點(dian)的(de)分(fen)子(zi)才(cai)會(hui)進入(ru)文庫(ku)制(zhi)備、PCR 擴(kuo)增和 NGS 的(de)後(hou)續步(bu)驟，以揭(jie)示(shi)易(yi)受 Cas9 切(qie)割(ge)影(ying)響(xiang)的序(xu)列(lie)。

作為(wei)壹種(zhong)體(ti)外(wai)試驗(yan)，CIRCLE-seq 避(bi)免(mian)了(le) CRISPR QC 基於(yu)細胞的(de)方法(fa)中冗(rong)長的細胞培(pei)養步(bu)驟。此外，CIRCLE-seq 是壹種(zhong)可(ke)擴展、靈(ling)敏的技(ji)術(shu)，與其(qi)他(ta)體(ti)外(wai)方法(fa)相(xiang)比(bi)，需要(yao)更(geng)少(shao)的測序(xu)讀數(shu)，從(cong)而降(jiang)低(di)測序成(cheng)本。CIRCLE-seq 的(de)成(cheng)功(gong)需要(yao)使(shi)用 CRISPR基因(yin)編輯試劑(ji)等進行(xing)高(gao)效的文庫(ku)制(zhi)備，可(ke)減少文庫(ku)擴(kuo)增(zeng)過程中擴增(zeng)偏(pian)差(cha)的高(gao)保真(zhen) DNA 聚(ju)合(he)酶(mei)。

  基於(yu) NGS 的(de)工具(ju)可(ke)在(zai)每(mei)個階(jie)段對(dui) CRISPR/Cas9 介導的(de)編輯進(jin)行(xing)核(he)苷(gan)酸水(shui)平的驗(yan)證(zheng)。

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