慢(man)病毒(du)包裝(zhuang)常(chang)見問(wen)題(ti)匯(hui)總(zong)

 Q: 什麽(me)是(shi)MOI？
 
A: 在(zai)微生物(wu)學中， MOI是病原(yuan)體(如噬菌體或病毒(du)、細菌等(deng))與感染(ran)目標(biao)(如(ru)細胞)的(de)比率。對於病毒(du)， MOI是病毒(du)顆(ke)粒數(shu)量與特定(ding)空間中存在(zai)的(de)目標(biao)細胞數(shu)量的(de)比率。通(tong)常(chang)可將(jiang)某株細胞有(you)80%被感(gan)染(ran)時所(suo)用(yong)的(de)病毒(du)顆(ke)粒數(shu)和細胞數(shu)目的(de)比值作(zuo)為該株細胞的(de)MOI。
 
  Q：如何稀釋病毒(du)？     
                                                                           
A：您(nin)可使(shi)用完(wan)培(pei)、PBS液(ye)等(deng)將(jiang)病毒(du)稀釋到需(xu)要的(de)滴度。如(ru)將(jiang)滴度為5 x 109 TU/ml的(de)病毒(du)稀釋到1 x109TU/ml，則需取20 µl病毒(du)液加(jia)入到80 µl的(de)完培(pei)中。
 
  Q：用於病毒(du)感染(ran)的(de)細胞接(jie)種(zhong)量是(shi)多(duo)少(shao)？       
                                                     
A: 根據(ju)細胞增殖(zhi)的(de)速(su)度(du)調整細胞接(jie)種(zhong)量，以(yi)保(bao)證在(zai)感染(ran)後3天(tian)左右(you)細胞剛(gang)好快(kuai)長(chang)滿培(pei)養(yang)皿(min)底(di)部(bu)為宜(yi)。針(zhen)對(dui)大(da)部(bu)分(fen)細胞系(xi)： 傳代周(zhou)期(qi)在(zai)2-3天(tian)，感(gan)染(ran)時細胞鋪板的(de)密度保(bao)持在(zai)20-30%左右(you)，則72h後細胞增殖(zhi)後鋪板密(mi)度(du)約(yue)在(zai)90%左右(you)；針(zhen)對(dui)某些原(yuan)代細胞： 由(you)於細胞增長(chang)緩(huan)慢(man)，可以(yi)在(zai)接種(zhong)時提(ti)高(gao)匯(hui)合度到50%～ 60%，但(dan)要確(que)保(bao)在(zai)感染(ran)後3天(tian)時(shi)細胞匯(hui)合度達到90%～ 100%；針(zhen)對(dui)非(fei)分(fen)裂細胞： 如(ru)神經元細胞，接(jie)種(zhong)後不(bu)再增殖(zhi)，此時(shi)可以(yi)按(an)照80%的(de)匯合度(du)進(jin)行(xing)接種(zhong)。
 
  Q：如何(he)提(ti)高(gao)病毒(du)對細胞的(de)感染(ran)效率？      
                                                        
A：病毒(du)對細胞的(de)感染(ran)效率受細胞自(zi)身生長(chang)的(de)狀(zhuang)態(tai)，細胞數(shu)量，細胞被病毒(du)感染(ran)的(de)難易程度(du)等(deng)多(duo)個(ge)因(yin)素(su)影(ying)響。因(yin)此保(bao)證細胞生長(chang)狀(zhuang)態(tai)良(liang)好，輪(lun)廓(kuo)清晰(xi)，合適的(de)細胞密(mi)度，選擇較(jiao)好的(de)感染(ran)條件(jian)（如(ru)合(he)適的(de)MOI值）可以(yi)更好的(de)保(bao)證感染(ran)效率。對於懸浮(fu)細胞，可采(cai)用離(li)心感染(ran)方(fang)法(fa)，減少(shao)病毒(du)感染(ran)時的(de)體積，從而提(ti)高感(gan)染(ran)效率。如可以(yi)在(zai)加入(ru)病毒(du)後將細胞培(pei)養(yang)板(ban)密(mi)封，用(yong)離(li)心機(ji)在(zai)1000g條件(jian)下(xia)離(li)心1h，再放(fang)回(hui)培(pei)養(yang)箱(xiang)中正常(chang)培(pei)養(yang)。
 
  Q：加(jia)入(ru)病毒(du)病毒(du)後，細胞死亡很(hen)厲害(hai)，該如(ru)何(he)處理？  
                                               
A：病毒(du)有壹(yi)定的(de)細胞毒(du)性(xing)，如(ru)果(guo)培(pei)養(yang)過程中細胞出(chu)現(xian)了(le)明顯的(de)病變或細胞狀(zhuang)態(tai)變差，建(jian)議將(jiang)轉導時(shi)間縮(suo)短(duan)至5~8小時之(zhi)間。或者(zhe)調整並降低(di)感(gan)染(ran)的(de)MOI值，並(bing)且在(zai)感染(ran)後4小時、 8 小時(shi)、 12小(xiao)時對細胞進(jin)行(xing)觀察(cha)，若(ruo)發現(xian)細胞狀(zhuang)態(tai)變差時(shi)，則需要立刻對細胞進(jin)行(xing)換(huan)液(ye)操(cao)作，使用新鮮的(de)完培(pei)替換(huan)病毒(du)感染(ran)培(pei)養(yang)液(ye)
 
  Q：細胞能(neng)被病毒(du)感染(ran)，但(dan)為何GFP熒(ying)光很弱(ruo)？
                                                    
A：GFP病毒(du)感染(ran)細胞後，細胞中熒光(guang)強(qiang)度取決(jue)於病毒(du)進入(ru)到細胞的(de)顆(ke)粒數(shu)、細胞本(ben)身的(de)增殖(zhi)狀(zhuang)態(tai)、細胞類(lei)等(deng)因(yin)素(su)。在(zai)增殖(zhi)較(jiao)慢(man)的(de)細胞中感染(ran)病毒(du)後， GFP蛋白表(biao)達達到峰(feng)值需(xu)要較(jiao)長(chang)的(de)時間。 
 
  Q：腺(xian)病毒(du)載體在(zai)體外(wai)實驗中應註(zhu)意(yi)哪(na)些(xie)問(wen)題(ti)？    
                                                  
A：由(you)於細胞表(biao)面受體的(de)差異(yi)，腺病毒(du)載體在(zai)不(bu)同的(de)細胞中轉導(dao)效(xiao)率不(bu)同，可以(yi)通(tong)過預實驗來(lai)判(pan)斷目的(de)細胞中的(de)腺病毒(du)用量(liang)。病毒(du)感染(ran)細胞的(de)最佳(jia)時(shi)期(qi)是細胞處於對數(shu)生長(chang)期(qi)時，因(yin)此，在(zai)細胞消(xiao)化後12～24小時加入(ru)病毒(du)。病毒(du)感染(ran)時細胞培(pei)養(yang)液(ye)的(de)體積盡(jin)量小(xiao)壹些(xie)，以(yi)全(quan)覆(fu)蓋(gai)細胞為(wei)準。壹般感染(ran)腺病毒(du)24 小時(shi)後就能(neng)檢(jian)測到目的(de)基因(yin)的(de)表(biao)達，48 小(xiao)時表(biao)達達到較(jiao)高(gao)水平(ping)。
 
  Q：如何(he)確(que)定我(wo)所(suo)用(yong)的(de)目的(de)細胞是(shi)否(fou)可以(yi)被腺(xian)病毒(du)感染(ran)？ 
 
A：腺病毒(du)有廣(guang)泛的(de)宿主(zhu)範(fan)圍,它可以(yi)感(gan)染(ran)人(ren)類或者(zhe)其(qi)他哺(bu)乳(ru)動物(wu)細胞系(xi)或原代細胞，包括(kuo)可分(fen)裂的(de)和不(bu)可分(fen)裂的(de)細胞。只(zhi)有(you)少(shao)數細胞系(xi)不(bu)被感(gan)染(ran)，例如(ru)壹(yi)些(xie)淋巴細胞系(xi)對腺病毒(du)有更強的(de)抵抗(kang)性(xing)。為(wei)了(le)確(que)認(ren)所(suo)使用的(de)目的(de)細胞是(shi)否(fou)能(neng)夠(gou)被腺(xian)病毒(du)感染(ran)，需要通(tong)過帶有(you)標(biao)記（如(ru)GFP）的(de)腺病毒(du)對目的(de)細胞進(jin)行(xing)預實驗。
 

蘇州(zhou)阿爾法(fa)生物(wu)攜(xie)手(shou)海(hai)星提供的(de)服務如下(xia)：

|   慢(man)病毒(du)包裝(zhuang)服(fu)務：
我們可以(yi)提(ti)供研(yan)究(jiu)所(suo)需(xu)敲(qiao)除(chu)質粒載體構(gou)建和慢病毒(du)包裝(zhuang)服(fu)務。我們的(de)慢病毒(du)載體來源(yuan)於HIV-1病毒(du)，序列經(jing)過精(jing)心優(you)化，提高了(le)生物(wu)安(an)全(quan)性(xing)、基因(yin)表(biao)達水平(ping)和病毒(du)轉導(dao)效率。慢病毒(du)可將(jiang)特定(ding)基因(yin)片段(duan)隨(sui)機(ji)、穩定地(di)整合(he)到宿(xiu)主(zhu)細胞的(de)基因(yin)組(zu)中，實現(xian)目的(de)基因(yin)的(de)持續穩定的(de)表(biao)達目的(de)產物(wu)，因(yin)此，目前慢病毒(du)載體已經廣(guang)泛(fan)地應用(yong)於基因(yin)的(de)表(biao)達調控如過表(biao)達，幹擾(rao)和(he)基因(yin)敲(qiao)除(chu)。
 
 
|   腺病毒(du)（AV）包裝(zhuang)服(fu)務：
腺病毒(du)載體（Adenovirus）能(neng)夠(gou)攜帶大(da)片(pian)段(duan)外(wai)源(yuan)DNA、感染(ran)分(fen)裂細胞和(he)非分(fen)裂細胞、誘(you)導體液和細胞免(mian)疫應答(da)（這對於疫苗(miao)開發(fa)是(shi)有(you)益(yi)的(de)）、表(biao)現(xian)出高(gao)效(xiao)率的(de)轉導和(he)高(gao)水平(ping)的(de)轉基因(yin)表(biao)達、不(bu)整(zheng)合(he)細胞DNA（在(zai)細胞內(nei)保(bao)持dsDNA遊離(li)體）。
我們提供第(di)壹(yi)代腺病毒(du)（E1/E3-deleted Ad5）和嵌(qian)合型(xing)腺(xian)病毒(du)（Chimeric adenovirus）包裝(zhuang)服(fu)務。Ad5病毒(du)的(de)感染(ran)是通(tong)過病毒(du)顆(ke)粒表(biao)面的(de)纖突（Fiber）與細胞表(biao)面受體CAR（Coxsackie virus and adenovirus receptor）特異性(xing)結合而(er)介導的(de)。 並不(bu)是(shi)所(suo)有細胞都(dou)高表(biao)達CAR，Ad5病毒(du)在(zai)某些不(bu)表(biao)達或者(zhe)低(di)表(biao)達CAR的(de)細胞種(zhong)類上(shang)的(de)應用受限(xian)。我們開發(fa)了(le)嵌合(he)型(xing)腺(xian)病毒(du)，它的(de)感染(ran)是通(tong)過嵌(qian)合型(xing)纖(xian)突(tu)（Chimeric fiber）與細胞表(biao)面分(fen)子CD46特異(yi)性(xing)結合而(er)介導的(de)。
 
|  腺相關病毒(du)（AAV）包裝(zhuang)服(fu)務：
腺相關病毒(du)(AAV)是壹(yi)種(zhong)人(ren)細小病毒(du)，目前因(yin)為能(neng)作(zuo)為壹種(zhong)基因(yin)治(zhi)療載體而受到廣(guang)泛關(guan)註(zhu)。腺(xian)相關病毒(du)主(zhu)要以(yi)遊離(li)於染(ran)色體的(de)附(fu)加形式存(cun)在(zai)，並可長(chang)期(qi)存在(zai)於非分(fen)裂期(qi)的(de)細胞中。由於具(ju)有高(gao)組(zu)織(zhi)特(te)異(yi)性(xing)、低(di)免(mian)疫原(yuan)性(xing)、良(liang)好的(de)擴(kuo)散(san)性(xing)、高(gao)安(an)全性(xing)以(yi)及宿主(zhu)範(fan)圍廣等(deng)特(te)點(dian)，AAV特(te)別適(shi)用(yong)於體內的(de)研(yan)究(jiu)，且(qie)已成為(wei)基因(yin)治(zhi)療領(ling)域(yu)中具(ju)有前景(jing)的(de)病毒(du)載體之(zhi)壹(yi)。我(wo)們開發(fa)出壹(yi)系(xi)列專有技術(shu)和(he)試(shi)劑(ji)，從病毒(du)滴度(du)、純(chun)度、活性(xing)以(yi)及壹致(zhi)性(xing)等(deng)方(fang)面顯(xian)著(zhu)提(ti)升(sheng)了(le)腺相關病毒(du)包裝(zhuang)工藝水平(ping)。

更多技(ji)術(shu)服(fu)務相關內(nei)容進入蘇州(zhou)阿爾法(fa)生物(wu)實驗器(qi)材(cai)有(you)限(xian)公司(si)進(jin)行(xing)了(le)解。