慢(man)病(bing)毒(du)包裝(zhuang)步(bu)驟

1. 重(zhong)組(zu)慢(man)病(bing)毒(du)的制備(bei)

Day1: 匯合度90%的10cm dishs HEK293T細(xi)胞(bao)（~ 6×107/dish）按1：1比(bi)例傳代(dai)至(zhi)15cm dishs，第(di)二(er)天(tian)細胞(bao)匯合度達到90%-95%（~ 1.5×108/dish），培(pei)養(yang)基為Gibico高(gao)糖DMEM培(pei)養(yang)基（含10%FBS）。

Day2: 轉(zhuan)染(ran)前(qian)2-3個(ge)小(xiao)時更(geng)換培養(yang)基（含10%FBS)；

2)按照以下比例配制轉(zhuan)染試劑(ji)：

Mix 1體(ti)積(ji)μlMix 2量(liang)DMEM（無(wu)FBS）1000μlDMEM（無(wu)FBS）1000μl目(mu)的基因質(zhi)粒25μgVGF190μl（1μg/μl）PMD2G7.5μgPSPAX215μg

Mix 1和(he)Mix 2分(fen)別混(hun)合後，室溫5-10min, 後(hou)將(jiang)Mix 1和(he)Mix 2混(hun)合，室溫30min，加(jia)入(ru)至(zhi)15cm dish中。（細胞(bao)達到匯合度90%，細(xi)胞(bao)過(guo)少(shao)會(hui)影(ying)響轉(zhuan)染效(xiao)率(lv)）

Day3: 6h-24h內(nei)更(geng)換新(xin)鮮(xian)培養基（含10%FBS），觀察(cha)轉染(ran)效(xiao)率(lv)並(bing)拍照。

Day5: 72h觀察(cha)細胞(bao)狀(zhuang)態並拍照。收(shou)取(qu)上清(qing)培養(yang)基，過0.45μm濾(lv)膜(mo)，上清(qing)培養基加入(ru)超(chao)速離(li)心(xin)管中，配平(ping)後(hou)離(li)心(xin)，25000rpm，4℃離(li)心(xin)1.5h。棄(qi)上(shang)清(qing)，用(yong)適當(dang)病(bing)毒(du)保(bao)存液回(hui)溶混(hun)勻(yun)溶解(jie)過(guo)夜。

Day6：收(shou)集病(bing)毒(du)分裝(zhuang)，進行病(bing)毒(du)滴(di)度(du)測定(ding)。

2. 重(zhong)組(zu)慢(man)病(bing)毒(du)滴(di)度(du)測定(ding)

2.1 整(zheng)合數法(fa)標(biao)定(ding)不帶熒光的重(zhong)組慢(man)病(bing)毒(du)滴(di)度(du)

2.1.1 病(bing)毒(du)感(gan)染(ran)細胞(bao)

①感(gan)染(ran)前6 h 在(zai)24孔(kong)細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)板(ban)中以2.5×105個(ge)細(xi)胞(bao)/孔(kong) 均(jun)勻(yun)接種(zhong)HEK293細(xi)胞(bao)。

②將(jiang)慢(man)病(bing)毒(du)進行梯度稀(xi)釋(shi)，共(gong)做(zuo)3個(ge)梯(ti)度(du)，即每孔（500μl 無(wu)雙抗(kang)、無(wu)血(xue)清的DMEM培(pei)養(yang)基）中含10 μl、1 μl、0.1 μl 病(bing)毒(du)，振(zhen)蕩混(hun)勻(yun)後(hou)加(jia)至(zhi)接種(zhong)好細胞(bao)的24孔(kong)板(ban)中，加病(bing)毒(du)之(zhi)前(qian)將培養(yang)板(ban)中的培(pei)養基吸凈。

③感(gan)染(ran) 18-20h 後(hou)，將(jiang)培(pei)養板中的培(pei)養基更(geng)換為新(xin)鮮(xian)的DMEM完(wan)培(pei)。

④感(gan)染(ran) 64-68h 後(hou)收(shou)集細胞(bao)並(bing)進行基因組(zu)DNA的提取。

⑤測(ce)定(ding)時(shi)，設(she)置壹(yi)組帶熒光的已(yi)知(zhi)TU的慢(man)病(bing)毒(du)作為對(dui)照，以校(xiao)驗檢測出(chu)的數(shu)值。

2.1.2 提取基因組(zu)DNA（按照AxyGEN 的基因組(zu)DNA提取試劑(ji)盒(he)說明(ming)書(shu)進行操(cao)作）

2.1.3 qPCR檢測

① 以(yi)被測(ce)慢病(bing)毒(du)載體(ti)梯(ti)度(du)稀(xi)釋為標(biao)準品(pin)，慢病(bing)毒(du)載體(ti)上(shang)的通(tong)用(yong)引(yin)物(wu)進行qPCR以(yi)獲得(de)病(bing)毒(du)整合拷貝數。

② 以(yi)Actin質(zhi)粒梯(ti)度(du)稀釋(shi)為標(biao)準品(pin)，Actin引(yin)物(wu)進行qPCR檢測樣(yang)品(pin)的基因組(zu)拷(kao)貝數以(yi)得到(dao)基因組(zu)拷(kao)貝數。

③ qPCR

qPCR反(fan)應(ying)體(ti)系(xi)如(ru)下：

組(zu)成成分(fen)體(ti)積(ji)2 × SYBR Green mix10 μlPrimers (Forward & Reverse mixture)0.8 μl超(chao)純(chun)水(shui)（DNase & RNase Free）7.2μl模(mo)板2μlTotal20μl

qPCR反(fan)應(ying)程序(xu)：

循(xun)環(huan)參(can)數(shu)預(yu)變性95℃ 3min；95℃ 5S；60℃ 15S；72℃ 15S+Plate Read39個(ge)循(xun)環(huan)

2.1.4 計(ji)算慢(man)病(bing)毒(du)IU（Integration Unit）/ml

IU/ml=(C×N×D×1000)/V

註(zhu)：C=平(ping)均(jun)每(mei)基因組(zu)慢(man)病(bing)毒(du)整合拷貝數D=病(bing)毒(du)的稀(xi)釋倍數N=感(gan)染(ran)時細胞(bao)的數(shu)目(mu)（約為2.5×10E5）V=加(jia)入(ru)稀(xi)釋病(bing)毒(du)的體(ti)積(ji)數(shu)

2.2 孔(kong)稀(xi)釋(shi)法(fa)標(biao)定(ding)帶熒光的重(zhong)組慢(man)病(bing)毒(du)滴(di)度(du)

Day1: 細(xi)胞(bao)的準備(bei)

在(zai)96孔(kong)板(ban)中的每(mei)個孔(kong)中接種(zhong)1-4×104個(ge) HEK293細(xi)胞(bao)。

Day2: 病(bing)毒(du)的稀(xi)釋與感(gan)染(ran)

在(zai)Eppendorf管中做10倍梯度稀釋(shi)，分別是(shi)1~10-6梯(ti)度(du)。棄(qi)去96孔(kong)板(ban)中原有(you)的培(pei)養基，將稀(xi)釋(shi)好的病(bing)毒(du)依次加入孔中，註意(yi)是(shi)兩(liang)個(ge)重(zhong)復(fu)，並做(zuo)好標(biao)記。

Day5: 熒(ying)光(guang)計(ji)數與滴(di)度(du)計算

感(gan)染(ran)72h後(hou)，用(yong)熒光顯微鏡(jing)對(dui)熒(ying)光陽(yang)性細(xi)胞(bao)進行計數。數(shu)出(chu)最後兩(liang)孔(kong)的熒(ying)光細(xi)胞(bao)數(shu)，計(ji)算2個(ge)重(zhong)復(fu)孔內的總(zong)數(shu)之(zhi)和(he)並計算出(chu)平(ping)均(jun)數(shu)，假設(she)為A（倒數(shu)第(di)二(er)孔的熒(ying)光細(xi)胞(bao)平(ping)均(jun)數(shu)）和(he)B（倒數(shu)第(di)壹(yi)孔的熒(ying)光細(xi)胞(bao)平(ping)均(jun)數(shu)）。

慢(man)病(bing)毒(du)滴(di)度(du)計算公(gong)式：病(bing)毒(du)滴(di)度(du) (TU/ml) = （A+B×10）×1000/2/A孔(kong)病(bing)毒(du)量(liang)（μl）

3. 慢(man)病(bing)毒(du)的使用(yong)

3.1 重(zhong)組(zu)慢(man)病(bing)毒(du)體(ti)外(wai)感(gan)染(ran)細胞(bao)

不同(tong)的細(xi)胞(bao)所(suo)使用(yong)的病(bing)毒(du)MOI值(zhi)會(hui)有(you)所(suo)不同(tong)。建(jian)議(yi)在正(zheng)式實(shi)驗前，在(zai)目(mu)的細(xi)胞(bao)中進行預實驗摸(mo)索最佳MOI值(zhi)。

3.1.1 慢(man)病(bing)毒(du)感(gan)染(ran)目(mu)的細(xi)胞(bao)預(yu)實(shi)驗

為了(le)節省(sheng)病(bing)毒(du)，推薦使用(yong)96孔(kong)板(ban)進行預實驗。操(cao)作步(bu)驟如(ru)下：

①Day1 細(xi)胞(bao)的準備(bei)

將(jiang)目(mu)的細(xi)胞(bao)接(jie)種(zhong)於96孔(kong)板(ban)中，細胞(bao)融合率為50%為最佳。為保(bao)證(zheng)細(xi)胞(bao)生(sheng)長良好，請保(bao)證(zheng)細(xi)胞(bao)貼(tie)壁(bi)過夜(ye)。

②Day2 病(bing)毒(du)的稀(xi)釋

取(qu)10μL慢(man)病(bing)毒(du)原液加(jia)入(ru)90μL培(pei)養(yang)液中做1:10稀(xi)釋(shi)（10-1），以(yi)此為起點(dian)做(zuo)梯度(du)稀釋直至稀(xi)釋10-7。可根據(ju)實(shi)際情況降(jiang)低(di)或提高稀(xi)釋(shi)倍數。

③Day2 感(gan)染(ran)目(mu)的細(xi)胞(bao)

取(qu)出(chu)提前準備(bei)好的96孔(kong)板(ban)，用(yong)準備(bei)好的病(bing)毒(du)稀釋液替(ti)代舊(jiu)培養(yang)液，註(zhu)意(yi)保(bao)留(liu)未(wei)加入(ru)病(bing)毒(du)的細(xi)胞(bao)孔(kong)作為對(dui)照組。

④第(di)Day2~Day10 觀察(cha)熒光(guang)或檢測

慢(man)病(bing)毒(du)對(dui)細(xi)胞(bao)的感(gan)染(ran)較慢，請在(zai)感(gan)染(ran)細胞(bao)後(hou)48、72、96、120小(xiao)時分別觀察(cha)細胞(bao)中熒光(guang)表(biao)達情況（如(ru)果您(nin)選(xuan)擇(ze)的產品(pin)不帶有(you)熒光(guang)標(biao)簽，請(qing)在48、72、96、120小(xiao)時分別收(shou)獲細(xi)胞(bao)並(bing)通(tong)過(guo) Western-Blot 或其(qi)他檢測手(shou)段來檢測基因表(biao)達）。

註(zhu)意(yi)：由於(yu)不同(tong)細(xi)胞(bao)對(dui)慢(man)病(bing)毒(du)感(gan)染(ran)過程的承(cheng)受(shou)能(neng)力(li)不同(tong)，在(zai)加入(ru)病(bing)毒(du)稀釋液後(hou)，請(qing)於12-24小(xiao)時後觀察(cha)細胞(bao)狀(zhuang)態以確(que)認加入(ru)的病(bing)毒(du)量(liang)是(shi)否(fou)合適。

3.1.2 慢(man)病(bing)毒(du)感(gan)染(ran)目(mu)的細(xi)胞(bao)

進行慢病(bing)毒(du)感(gan)染(ran)實驗時可使用(yong)完培（培養(yang)目(mu)的細(xi)胞(bao)用(yong)）稀釋。培養(yang)液中的血(xue)清、雙抗(kang)或其(qi)他營(ying)養因子(zi)不會(hui)影(ying)響慢(man)病(bing)毒(du)的感(gan)染(ran)效(xiao)率(lv)。

以(yi)24 孔(kong)培(pei)養(yang)板為例，進行HEK293細(xi)胞(bao)的感(gan)染(ran)實驗操(cao)作步(bu)驟如(ru)下：

註(zhu)意(yi)：實驗前請(qing)按照不同(tong)的MOI 設(she)置不同(tong)的感(gan)染(ran)孔，並根據(ju)MOI 和(he)細(xi)胞(bao)數(shu)量(liang)計(ji)算所(suo)需(xu)要(yao)的病(bing)毒(du)量(liang)。

最適病(bing)毒(du)用(yong)量(liang)的計(ji)算公(gong)式：病(bing)毒(du)用(yong)量(liang)TU=最佳MOI×細(xi)胞(bao)數(shu)目(mu)/病(bing)毒(du)滴(di)度(du)

例如, 如(ru)果(guo)您(nin)目(mu)的細(xi)胞(bao)的最佳MOI=10，您(nin)需(xu)要(yao)感(gan)染(ran)106的細(xi)胞(bao)，那(na)麽(me)您(nin)共計(ji)需(xu)要(yao)107 TU的病(bing)毒(du). 如(ru)果(guo)病(bing)毒(du)滴(di)度(du)為1×108 TU/mL, 那(na)麽(me)您(nin)實驗需(xu)要(yao)的病(bing)毒(du)量(liang)就(jiu)是(shi)100μL.

① Day1 細(xi)胞(bao)的準備(bei)

在(zai)24孔(kong)培(pei)養(yang)板接種(zhong)若(ruo)幹(gan)孔，每(mei)個孔(kong)內接種(zhong)3-5×104個(ge)HEK 293細(xi)胞(bao)，鋪(pu)板(ban)時(shi)細胞(bao)的融合率為50%左(zuo)右，每(mei)孔(kong)培養(yang)液體(ti)積(ji)為300μL，進行病(bing)毒(du)感(gan)染(ran)時細胞(bao)的匯合度約為70%。

②Day2 病(bing)毒(du)的準備(bei)

根(gen)據(ju)實(shi)驗的實(shi)際情況和(he)MOI 值(zhi)，用(yong)培養液準確(que)稀釋慢(man)病(bing)毒(du)原液。

註(zhu)意(yi)：可使用(yong)PBS緩沖液或無血清(qing)培(pei)養(yang)液稀(xi)釋(shi)病(bing)毒(du)原液。

③Day2 感(gan)染(ran)目(mu)的細(xi)胞(bao)

在(zai)目(mu)的細(xi)胞(bao)和(he)對(dui)照細胞(bao)中分別加入計算好的病(bing)毒(du)液， 混(hun)勻(yun)後(hou)放於CO2培(pei)養(yang)箱(xiang)（37 ℃、5% CO2）孵(fu)育過夜(ye)。

註(zhu)意(yi)：1）感(gan)染(ran)前細胞(bao)的狀(zhuang)態好壞對(dui)最終的感(gan)染(ran)效(xiao)果(guo)高(gao)低(di)影(ying)響很大(da)，請務(wu)必(bi)保(bao)證(zheng)加(jia)入病(bing)毒(du)前，細胞(bao)處(chu)於(yu)良好的生(sheng)長狀(zhuang)態。

2）若(ruo)慢病(bing)毒(du)對(dui)目(mu)的細(xi)胞(bao)的感(gan)染(ran)效(xiao)率(lv)較(jiao)低(di)，可通過(guo)提高MOI 值(zhi)提高病(bing)毒(du)的感(gan)染(ran)效(xiao)率(lv)，也可在培(pei)養(yang)液中加入(ru)維(wei)真(zhen)生(sheng)物助感(gan)染(ran)試劑(ji)ADV-HR來(lai)提高病(bing)毒(du)的感(gan)染(ran)效(xiao)率(lv)。

④Day3 更(geng)換培養(yang)液

病(bing)毒(du)感(gan)染(ran)細胞(bao)24小(xiao)時後，更(geng)換培養(yang)液。

註(zhu)意(yi)：換液具(ju)體(ti)時(shi)間需(xu)視(shi)細(xi)胞(bao)狀(zhuang)態而定(ding)。如(ru)果慢(man)病(bing)毒(du)對(dui)細(xi)胞(bao)有(you)明顯(xian)毒性作用(yong)，影(ying)響細(xi)胞(bao)生(sheng)長狀(zhuang)態，最短可於加(jia)病(bing)毒(du)4小(xiao)時後更(geng)換新(xin)鮮(xian)培養液後(hou)繼(ji)續(xu)培養(yang)。

⑤Day6 感(gan)染(ran)效(xiao)率(lv)檢測

在(zai)倒置熒光(guang)顯(xian)微鏡(jing)觀察(cha)熒光(guang)，計算慢(man)病(bing)毒(du)感(gan)染(ran)目(mu)的細(xi)胞(bao)的效(xiao)率(lv)。如(ru)選(xuan)擇(ze)的慢(man)病(bing)毒(du)載體(ti)不帶有(you)熒光(guang)標(biao)記，可以通(tong)過(guo)Q-PCR(定(ding)量(liang)PCR)檢測目(mu)的基因的表(biao)達來評估感(gan)染(ran)效(xiao)率(lv)。

註(zhu)意(yi)：1）慢(man)病(bing)毒(du)表(biao)達較慢(man)，熒光表(biao)達所(suo)需(xu)時(shi)間較長，建(jian)議(yi)感(gan)染(ran)96小(xiao)時後觀察(cha)熒光(guang)的表(biao)達。

2）感(gan)染(ran)後的細(xi)胞(bao)可以連(lian)續(xu)培養(yang)壹(yi)周，通過觀察(cha)熒光(guang)表(biao)達的時(shi)間和強(qiang)度(du)來確(que)定(ding)慢(man)病(bing)毒(du)對(dui)目(mu)的細(xi)胞(bao)的感(gan)染(ran)情況。

3）感(gan)染(ran)期間，請根(gen)據(ju)細胞(bao)生(sheng)長的情況及時(shi)換(huan)液，以(yi)保(bao)證(zheng)細(xi)胞(bao)良好的生(sheng)長狀(zhuang)態。

蘇(su)州(zhou)阿(e)爾法(fa)生(sheng)物提供細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)試劑(ji)、細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)設(she)備(bei)、細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)耗(hao)材(cai)、細(xi)胞(bao)株(zhu)、基因編(bian)輯(ji)細(xi)胞(bao)株(zhu)、所(suo)提供的CRISPR-Cas9表(biao)達病(bing)毒(du)具有(you)以下特(te)點：
1、病(bing)毒(du)產品(pin)現(xian)貨(huo)提供；
2、可以滿(man)足不同(tong)細(xi)胞(bao)的穩轉(zhuan)的需(xu)求(qiu)；
3、攜帶抗(kang)性用(yong)於穩轉(zhuan)構建(jian)；

4、表(biao)達穩定(ding)適合用(yong)於基因敲除(chu)；

更(geng)多內容進入蘇州阿(e)爾(er)法(fa)生(sheng)物實(shi)驗器材(cai)進行了(le)解。