單(dan)層(ceng)細(xi)胞系(xi)傳代培(pei)養(yang)指南

大(da)多數細胞系(xi)和原代細(xi)胞培(pei)養物(wu)生(sheng)長(chang)為(wei)單壹厚(hou)度的(de)細(xi)胞層(ceng)（單層(ceng)）或附著(zhe)在玻(bo)璃(li)或經過(guo)特殊(shu)處理的(de)塑料(liao)基質上(shang)的(de)薄片。為了保(bao)持培(pei)養(yang)物(wu)的(de)健(jian)康(kang)和積極(ji)生(sheng)長，通常需要定期(qi)對它們(men)進行傳(chuan)代培(pei)養(yang)。

   常見的傳代培(pei)養(yang)方法涉及(ji)通過使(shi)用(yong)蛋(dan)白(bai)水(shui)解(jie)酶(mei)（如(ru)胰蛋(dan)白(bai)酶(mei)或膠(jiao)原酶(mei)）破(po)壞(huai)細胞間(jian)和細(xi)胞與(yu)基質的(de)連(lian)接。在細胞解(jie)離(li)成(cheng)主(zhu)要(yao)由(you)單(dan)細胞組(zu)成(cheng)的懸浮(fu)液(ye)後(hou)，將(jiang)它們(men)稀(xi)釋並轉移到(dao)新的培養(yang)容器(qi)中。在那裏(li)它們(men)可(ke)以重新附著(zhe)並開(kai)始生(sheng)長和(he)分裂，經過(guo)壹段時(shi)間(jian)的(de)孵化(hua)後再(zai)次(ci)接近匯合。此(ci)時(shi)，它們(men)可(ke)以再(zai)次(ci)進行傳(chuan)代培(pei)養(yang)或用(yong)於實(shi)驗(yan)。

   以下指南描述(shu)了典(dian)型(xing)單層(ceng)細胞培(pei)養的(de)常規傳代和(he)維(wei)護所涉及(ji)的基本原(yuan)則。為了獲(huo)得壹(yi)致的(de)結(jie)果，保(bao)持(chi)良(liang)好的記錄(lu)很重要(yao)。記錄(lu)應包(bao)括(kuo)細胞傳(chuan)代日期(qi)和傳(chuan)代次(ci)數(shu)。

細胞周期(qi)性檢(jian)查(zha)

定期(qi)仔(zai)細(xi)檢(jian)查(zha)培養(yang)物(wu)以確定其狀態和健(jian)康(kang)狀況(kuang)是壹(yi)種(zhong)很好的(de)做(zuo)法。用肉(rou)眼檢(jian)查(zha)培養(yang)容器(qi)中的內(nei)容物(wu)，尋找微(wei)生(sheng)物(wu)汙(wu)染(ran)的(de)宏(hong)觀證(zheng)據(ju)，例如(ru)意(yi)外(wai)的(de) pH 值(zhi)變(bian)化或培(pei)養基中的濁(zhuo)度和(he)顆粒(li)。還要尋找通(tong)過(guo)顯(xian)微(wei)鏡可能不(bu)容易看(kan)到(dao)的小真菌(jun)菌(jun)落(luo)。這些菌(jun)落(luo)可能(neng)漂浮(fu)在介質-空(kong)氣(qi)界(jie)面上(shang)，尤其是在容器(qi)邊(bian)緣(yuan)周圍(wei)。

其次(ci)，使(shi)用(yong)倒(dao)置(zhi)顯(xian)微(wei)鏡檢(jian)查(zha)壹般(ban)細(xi)胞形(xing)態和生(sheng)長(chang)模(mo)式。仔(zai)細(xi)尋找微(wei)生(sheng)物(wu)汙(wu)染(ran)的(de)任(ren)何(he)微觀證(zheng)據(ju)。在某(mou)些細胞系(xi)中，漂浮(fu)在培養基中的細(xi)胞是細(xi)胞死亡的標誌。然而，許(xu)多細胞在有絲(si)分裂期(qi)間聚(ju)集(ji)，形(xing)成非常折射(she)（明亮）的球體，如(ru)果培(pei)養(yang)物(wu)受(shou)到(dao)物(wu)理幹(gan)擾(rao)，這些球體可(ke)能會(hui)自(zi)由漂浮(fu)。死細胞通(tong)常會(hui)聚(ju)集(ji)並分離，但(dan)通(tong)常不會(hui)折(zhe)射(she)。

除了這(zhe)些日常檢(jian)查(zha)外(wai)，定期(qi)培養(yang)細(xi)胞進行真菌(jun)和(he)細菌(jun)檢(jian)測(ce)，並檢(jian)測(ce)支(zhi)原體汙染(ran)情況(kuang)。有幾種(zhong)方法可用(yong)於(yu)檢(jian)查(zha)這些汙染物(wu)。有(you)關(guan)支(zhi)原體檢(jian)測(ce)試(shi)劑盒和細胞培(pei)養試(shi)劑的信息(xi)，請參閱(yue)蘇(su)州(zhou)阿爾(er)法生(sheng)物(wu)實(shi)驗(yan)器(qi)材(cai)網(wang)站。

準(zhun)備(bei)培養基

準(zhun)備(bei)推(tui)薦(jian)用(yong)於(yu)細胞系(xi)的新鮮培養基，並適(shi)當(dang)標記培(pei)養容器(qi)。壹(yi)定要(yao)添加補(bu)充劑(ji)並(bing)平(ping)衡(heng) pH 值(zhi)。在壹個 75 cm 2 的(de)燒瓶中，使(shi)用(yong)大約(yue) 12 至(zhi) 15 mL 的培養(yang)基。相應(ying)地(di)調整其他(ta)培養(yang)容器(qi)的(de)體(ti)積。

收(shou)獲(huo)細胞

大(da)多數細胞培(pei)養物(wu)如(ru)果(guo)在達(da)到(dao)匯合之前(qian)進行傳(chuan)代培(pei)養(yang)（仍然有壹(yi)些可用的(de)生(sheng)長空間(jian)），則生長(chang)最(zui)好。這(zhe)將有(you)助於(yu)使(shi)細(xi)胞保(bao)持在活躍的(de)對數生長期(qi)。應始(shi)終在為每(mei)個(ge)細胞系(xi)維(wei)護的記錄(lu)表(biao)上(shang)註(zhu)明(ming)任(ren)何(he)異常觀察結(jie)果。收(shou)集(ji)步(bu)驟(zhou)旨(zhi)在將細胞從其基質中去(qu)除(chu)，並(bing)盡(jin)可(ke)能(neng)溫和(he)地(di)破(po)壞(huai)細胞間(jian)的鍵(jian)合。對於大多數細胞培(pei)養，這(zhe)需(xu)要(yao)在緩(huan)沖鹽水(shui)溶(rong)液(ye)中使(shi)用(yong)化學(xue)或酶(mei)解(jie)離(li)劑(ji)。

  胰蛋(dan)白(bai)酶(mei) 是常見的解(jie)離(li)劑(ji)，通常以 0.05% 至(zhi) 0.25% 的濃度使(shi)用(yong)。適宜工(gong)作濃度通(tong)常是通(tong)過(guo)使(shi)用(yong)min濃度的(de)胰蛋(dan)白(bai)酶(mei)來確定的(de)，該(gai)胰(yi)蛋(dan)白(bai)酶(mei)會(hui)在相對較短(duan)的時(shi)間(jian)內(nei)（10 到(dao) 15 分鐘的(de)孵(fu)育）從基質中去(qu)除(chu)細(xi)胞並(bing)產生(sheng)單(dan)細(xi)胞懸(xuan)浮(fu)液(ye)。有(you)些細胞比其他(ta)細胞更(geng)難分離，因(yin)此(ci)胰蛋(dan)白(bai)酶(mei)溶(rong)液(ye)經常添加酶(mei)（如(ru)膠(jiao)原酶(mei)）或螯(ao)合劑（如(ru) EDTA）以改(gai)善結(jie)果。

    在含有哺(bu)乳動物(wu)來源血(xue)清的(de)培(pei)養(yang)基中生長(chang)的細(xi)胞需(xu)要洗(xi)滌以去(qu)除(chu)血(xue)清，因(yin)為胰(yi)蛋(dan)白(bai)酶(mei)會(hui)受(shou)到(dao)其存(cun)在的抑(yi)制。殘留(liu)血(xue)清通(tong)常是胰(yi)蛋(dan)白(bai)酶(mei)溶(rong)液(ye)無(wu)法將(jiang)細胞與(yu)底(di)物(wu)和(he)彼此(ci)分離的(de)原(yuan)因(yin)。有多種(zhong)緩(huan)沖鹽溶(rong)液(ye)可(ke)用(yong)。通常是基於Hanks 緩(huan)沖鹽水(shui)溶(rong)液(ye)、Earle 緩(huan)沖鹽溶(rong)液(ye)或 Dulbecco 磷(lin)酸(suan)鹽緩(huan)沖鹽溶(rong)液(ye)的(de)改(gai)進。如果(guo)要將這些制劑用(yong)於解(jie)離(li)細(xi)胞，通(tong)常會(hui)將(jiang)這(zhe)些制劑修(xiu)改(gai)為不(bu)含(han)鈣(gai)和鎂 (CMF-PBS)，因(yin)為這(zhe)兩(liang)種(zhong)離子(zi)在細胞與(yu)細(xi)胞和(he)細胞與(yu)基質的(de)附著(zhe)中起(qi)著(zhe)重要作用(yong)。

收(shou)獲(huo)單層(ceng)細胞的(de)步(bu)驟(zhou) 

1.取(qu)出並丟棄培養基。

2.用 5 mL 的(de)解(jie)離(li)溶(rong)液(ye)沖洗(xi)細胞片並取(qu)出。（本協議中使(shi)用(yong)的量(liang)適(shi)用(yong)於 75 cm 2燒瓶；對於其他(ta)容器(qi)中的培(pei)養物(wu)，按(an)比例(li)減少或增(zeng)加(jia)量(liang)。）如(ru)果(guo)解(jie)離(li)溶(rong)液(ye)含(han)有(you)胰蛋(dan)白(bai)酶(mei)，則去(qu)除(chu)所有(you)痕(hen)量(liang)的(de)血(xue)清非常重要，其中含有(you)胰蛋(dan)白(bai)酶(mei)抑(yi)制劑。

3.添加 2 至(zhi) 3 mL 的解(jie)離(li)溶(rong)液(ye)。每(mei) 5 分鐘用(yong)倒(dao)置(zhi)相差(cha)顯(xian)微(wei)鏡檢(jian)查(zha)壹次(ci)酶(mei)處(chu)理的(de)進度。特(te)別難以分離的(de)單(dan)分子層(ceng)可(ke)置(zhi)於 37°C 以促進分散。酶(mei)溶(rong)液(ye)的(de)預熱也(ye)會(hui)縮(suo)短(duan)暴露時(shi)間(jian)。為(wei)避(bi)免(mian)結(jie)塊，在等待(dai)細胞分離時(shi)不(bu)要(yao)通過(guo)敲打或搖(yao)動燒瓶來攪動細(xi)胞。

4.使(shi)用(yong)移液(ye)器(qi)將(jiang) 6 至(zhi) 8 mL 生長培(pei)養(yang)基添加到(dao)細胞懸(xuan)浮(fu)液(ye)中，並從培(pei)養容器(qi)底(di)部清洗(xi)所有(you)剩(sheng)余的細(xi)胞。此(ci)時(shi)，倒(dao)置(zhi)顯(xian)微(wei)鏡的快速(su)檢(jian)查(zha)應顯(xian)示(shi)細胞懸(xuan)浮(fu)液(ye)由(you)至(zhi)少 95% 的單細(xi)胞組(zu)成(cheng)。5.如果不是這(zhe)種(zhong)情況(kuang)，則可能(neng)需(xu)要更劇(ju)烈的(de)移液(ye)。

6.收(shou)集(ji)細胞懸(xuan)浮(fu)液(ye)，根(gen)據(ju)需要(yao)計(ji)數(shu)或分種(zhong)接種(zhong)物(wu)，然後分配到(dao)準(zhun)備(bei)好的培(pei)養(yang)容器(qi)中。對於某(mou)些細胞系(xi)和酶(mei)溶(rong)液(ye)（膠(jiao)原酶(mei)），有(you)必要(yao)在分配（接(jie)種(zhong)）細胞之前(qian)通(tong)過(guo)溫和(he)離(li)心（125 × g 5 分鐘）去(qu)除(chu)酶(mei)。

計(ji)數細(xi)胞或分裂懸(xuan)液(ye)

 為(wei)了確(que)定生(sheng)長(chang)速(su)率或建(jian)立(li)已(yi)知(zhi)濃度的(de)培養(yang)物(wu)，有(you)必(bi)要(yao)對懸浮(fu)細(xi)胞進行計(ji)數。可以使(shi)用(yong)血(xue)細胞計(ji)數器(qi)或電(dian)子細(xi)胞計(ji)數設(she)備(bei)。血(xue)細胞計(ji)數器(qi)的(de)優(you)點是價(jia)格較(jiao)低，同(tong)時(shi)可(ke)以進行存(cun)活率測(ce)定。

  輕(qing)輕(qing)混合細胞懸(xuan)浮(fu)液(ye)並(bing)取(qu)出 0.5 mL 等分試(shi)樣進行計(ji)數。向其中添加 0.5 mL 用(yong)於細(xi)胞計(ji)數的(de)重(zhong)要(yao)染色(se)劑(ji)，例如臺盼藍(lan)或赤(chi)蘚紅 B。混(hun)合均勻(yun)，取(qu)出樣品，然後小心地裝(zhuang)入幹凈的血(xue)細胞計(ji)數器(qi)。

    確(que)定細(xi)胞懸(xuan)浮(fu)液(ye)的(de)實(shi)際濃度（細(xi)胞數(shu)/mL）和存(cun)活(huo)率百分比，並(bing)計算(suan)以適當密度(du)接(jie)種(zhong)每(mei)個(ge)傳代培(pei)養(yang)物(wu)所需(xu)的(de)懸浮(fu)液(ye)體(ti)積。懸(xuan)浮(fu)液(ye)通(tong)常不計數細(xi)胞，而是分散在多個培養容器(qi)中。例如(ru)，1:2 拆分意(yi)味著將(jiang)壹個(ge)容器(qi)的(de)細(xi)胞懸(xuan)浮(fu)液(ye)分成兩(liang)個(ge)新容器(qi)，通(tong)常具(ju)有相(xiang)同(tong)的表(biao)面積。這(zhe)種(zhong)方法適用(yong)於(yu)細胞系(xi)的日常維(wei)護，其中跟蹤準(zhun)確的(de)細胞密度(du)並(bing)不重(zhong)要(yao)。 

平(ping)板培養(yang)

將(jiang)細胞懸(xuan)浮(fu)液(ye)的(de)適(shi)當等分試(shi)樣分配到(dao)準(zhun)備(bei)好的容器(qi)中（將濃縮(suo)細(xi)胞懸(xuan)浮(fu)液(ye)添加到(dao)空培養容器(qi)中會(hui)導(dao)致(zhi)細(xi)胞附著(zhe)和生(sheng)長不均勻(yun)）。生長(chang)較(jiao)快的培養(yang)物(wu)通(tong)常在較低濃度下建(jian)立(li)。除非最(zui)初添加min濃度的(de)細胞，否(fou)則壹些培養物(wu)不(bu)會(hui)生(sheng)長(chang)良(liang)好。然而，大(da)多數培養物(wu)在 10 3到(dao) 10 4 個細胞/cm 2或更(geng)高（7.5 × 10 4到(dao) 7.5 × 10 5個細胞/75-cm 2燒瓶）的初(chu)始濃度下會(hui)茁壯成長(chang)。 

重(zhong)新培(pei)養培(pei)養物(wu)

將(jiang)培(pei)養(yang)物(wu)放回(hui)振(zhen)蕩培(pei)養(yang)箱(xiang)中。大多數哺乳動物(wu)細(xi)胞培(pei)養物(wu)在 35°C 至(zhi) 37°C 之間的穩定溫度(du)下表(biao)現(xian)較(jiao)好(hao)。除(chu)了保(bao)持恒(heng)定溫度(du)外(wai)，用(yong)於(yu)培(pei)養(yang)皿和多孔板等未(wei)密封培(pei)養物(wu)的(de)培(pei)養(yang)箱(xiang)還必(bi)須(xu)保持(chi)高濕(shi)度和二(er)氧(yang)化(hua)碳水(shui)平(ping)。高(gao)濕度減少了未(wei)密封培(pei)養容器(qi)中的蒸(zheng)發(fa)損失，這(zhe)會(hui)導(dao)致(zhi)培(pei)養基變得(de)高(gao)滲並對細胞造(zao)成(cheng)壓力(li)。如果(guo)與(yu)含(han)有(you)適(shi)量(liang)碳酸(suan)氫(qing)鹽(yan)的(de)緩(huan)沖系(xi)統(tong)壹起(qi)使(shi)用(yong)，升高(gao)的(de)二(er)氧(yang)化(hua)碳水(shui)平(ping)（通(tong)常為 5% 至(zhi) 10%）有助於(yu)維(wei)持(chi)適當的 pH 值(zhi)（7.0 至(zhi) 7.6）。

   為了使(shi)這(zhe)種(zhong)類(lei)型(xing)的緩(huan)沖系(xi)統(tong)起(qi)作用(yong)，有(you)必要(yao)使(shi)用(yong)未密封（松開(kai)的蓋(gai)子）或透(tou)氣(qi)的(de)培(pei)養(yang)容器(qi)進行氣(qi)體(ti)交(jiao)換(huan)。如果(guo)沒有CO 2 ，緩(huan)沖系(xi)統(tong)可以在密閉(bi)容器(qi)中保持(chi)適當(dang)的(de) pH 值(zhi)。

   第(di)二(er)天(tian)檢(jian)查(zha)培養(yang)物(wu)以確保細胞重(zhong)新附著(zhe)並活(huo)躍生長。根(gen)據(ju)需要(yao)更(geng)換(huan)介質(zhi)；對於大多數活躍生長(chang)的(de)培(pei)養物(wu)來說，更換(huan)周期(qi)為約(yue)為(wei)每(mei)周 2 到(dao) 3 次。

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