hTERT-成(cheng)纖(xian)維細胞(bao)培(pei)養(yang)解決(jue)方(fang)案(an)

 hTERT成纖維細胞(bao)為(wei)永(yong)生化子(zi)宮內(nei)膜(mo)成纖維細胞(bao) (T HESC) 具有(you)延長的壽命，並且(qie)在(zai)核型(xing)、形(xing)態和(he)表(biao)型方面(mian)與(yu)原代親(qin)代(dai)細胞(bao)相(xiang)似(si)。在(zai)功能(neng)上(shang)，T HESCs 顯示(shi)激(ji)素(su)治(zhi)療(liao)後蛻膜化的(de)生化終(zhong)點。
  THESCs 來(lai)源於(yu)從患有(you)肌瘤(liu)的(de)成(cheng)年(nian)女性(xing)身上(shang)獲(huo)得(de)的(de)基(ji)質(zhi)細(xi)胞(bao)。原代基(ji)質(zhi)子(zi)宮內(nei)膜(mo)細胞(bao)通過(guo)用來(lai)自包裝細胞(bao)系(xi) pA317-hTERT 的(de)上(shang)清液(ye)感染(ran)而(er)永(yong)生化，該(gai)細胞(bao)系(xi)表(biao)達 hTERT 和嘌呤(ling)黴素(su)抗(kang)性(xing)基(ji)因(yin)。

hTERT成(cheng)纖維細胞(bao)培(pei)養(yang)方案(an)如下：
壹(yi)、所(suo)需(xu)材(cai)料(liao)
Dulbecco 改良(liang) Eagle 培養(yang)基(ji) (DMEM)/F12 (Sigma, D2906)
碳酸氫(qing)鈉
ITS+ Universal Culture Supplement Premix (BD, 354352)
嘌呤黴(mei)素(su)
木(mu)炭/葡聚(ju)糖(tang)處(chu)理(li)的(de)胎牛(niu)血(xue)清（Hyclone，SH30068.03）
胰(yi)蛋白酶-EDTA 溶液（HBSS 中的(de) 0.25% 胰(yi)蛋白酶/0.53 mM EDTA）
細胞(bao)培(pei)養(yang)測試(shi)的(de) DMSO 
實(shi)驗(yan)耗材：T75細胞(bao)培(pei)養(yang)瓶、T25細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)瓶、nest錐(zhui)形(xing)瓶(ping)、移液(ye)槍吸頭等
實(shi)驗(yan)室儀器：-80冰箱(xiang)、知楚(chu)二氧(yang)化碳振(zhen)蕩(dang)搖(yao)床、恒(heng)溫水(shui)浴(yu)鍋、瑞(rui)寧(ning)移液(ye)器、液氮(dan)罐(guan)、倒(dao)置(zhi)顯微(wei)鏡(jing)等
二、培(pei)養(yang)基(ji)的(de)制(zhi)備(bei)
這些細(xi)胞(bao)系(xi)的(de)基(ji)礎培(pei)養(yang)基(ji)是(shi) DMEM/F12，輔(fu)以：
1.5 克/升(sheng)碳酸氫(qing)鈉
1% ITS+ Universal Culture Supplement Premix
500 納克/毫(hao)升(sheng)嘌呤(ling)黴素(su)
10% 木(mu)炭/葡聚(ju)糖(tang)處(chu)理(li)的(de)胎牛(niu)血(xue)清
三(san)、冷凍細胞(bao)的(de)處(chu)理(li)程序(xu)和培養(yang)的啟動(dong)
為(wei)確保(bao)高活(huo)力(li)，解凍小瓶(ping)並在收(shou)到後盡快(kuai)開(kai)始培養(yang)。如果到(dao)達後需(xu)要(yao)儲(chu)存(cun)冷(leng)凍(dong)培養(yang)物(wu)，請(qing)將(jiang)小瓶(ping)儲(chu)存(cun)在(zai)液(ye)氮(dan)蒸氣中，而(er)不(bu)是(shi)-70°C。在(zai) -70°C 下(xia)儲(chu)存(cun)會導致活(huo)性(xing)喪失(shi)。
有(you)關從每(mei)批(pi) ATCC 子(zi)宮內(nei)膜(mo)成纖維細胞(bao)中回(hui)收的活(huo)細(xi)胞(bao)總(zong)數，請(qing)參閱(yue)產品(pin)信(xin)息表(biao)最後壹(yi)頁(ye)上(shang)提(ti)供的批(pi)次特(te)定信息。
準(zhun)備(bei)壹(yi)個含(han)有(you)推薦(jian)的培養(yang)基(ji)的(de) 25 cm² 或(huo) 75 cm² 培(pei)養(yang)瓶。在(zai)添(tian)加(jia)小瓶(ping)內容物(wu)之(zhi)前，應將(jiang)含有(you)生長培養(yang)基(ji)的(de)容器置於(yu)培(pei)養(yang)箱(xiang)中至(zhi)少(shao) 15 分鐘(zhong)，以使(shi)培養(yang)基(ji)達(da)到(dao)其(qi)正常 pH 值（7.0 至(zhi) 7.6），並避免(mian)在(zai)恢(hui)復過(guo)程中培(pei)養(yang)基(ji)堿度過(guo)高的(de)細胞(bao)。
在(zai) 37°C 水(shui)浴(yu)中輕(qing)輕攪(jiao)拌解(jie)凍小瓶(ping)。為(wei)減(jian)少(shao)汙(wu)染(ran)的(de)可能(neng)性，請(qing)將(jiang) O 形圈和(he)蓋(gai)子(zi)遠離水(shui)。解凍(dong)應該(gai)很快(kuai)（大(da)約(yue) 2 分鐘(zhong)）。
1.細(xi)胞(bao)解(jie)凍(dong)後，請(qing)盡快(kuai)從水(shui)浴(yu)鍋中取(qu)出，並(bing)使(shi)用 70% 乙(yi)醇溶液(ye)來(lai)進行凈化。操作過(guo)程需(xu)要(yao)在無菌環境(jing)中進行，避免(mian)汙(wu)染(ran)。
2.將(jiang)小瓶(ping)內容物(wu)轉(zhuan)移到(dao)含有(you) 6.0 至 8.0 mL 培(pei)養(yang)基(ji)的(de)離心管(guan)中，並(bing)以大(da)約(yue) 125 xg 的(de)速度將(jiang)細胞(bao)懸浮液離心 5 至(zhi) 7 分鐘(zhong)。
3.丟棄(qi)上(shang)清液(ye)並將(jiang)細胞(bao)重(zhong)新懸浮在新鮮(xian)的生長培養(yang)基(ji)中（有(you)關推(tui)薦(jian)的稀釋(shi)比(bi)，請(qing)參閱(yue)特定於(yu)批(pi)次(ci)的(de)信息）。將(jiang)此懸浮液添(tian)加(jia)到準備(bei)好的培(pei)養(yang)容器中。
4.在(zai) 37°C、5% CO 2加濕(shi)培(pei)養(yang)箱(xiang)中孵(fu)育培(pei)養(yang)物(wu)。
四(si)、繼代(dai)培養(yang)程序(xu)
使(shi)用nest的(de)T75錐(zhui)形瓶進行培養(yang)的體(ti)積(ji)。增(zeng)加(jia)或減(jian)少(shao)其(qi)他(ta)尺(chi)寸(cun)的(de)培(pei)養(yang)容器所(suo)需(xu)的(de)解離介質(zhi)的(de)量。
hTERT成(cheng)纖(xian)維細胞(bao)傳(chuan)代(dai)培(pei)養(yang)註意事項(xiang)：
為(wei)避免(mian)結塊，在等(deng)待細(xi)胞(bao)分離時(shi)不(bu)要(yao)敲打或搖(yao)動燒(shao)瓶(ping)。難(nan)以分離的細(xi)胞(bao)可置於(yu) 37°C 以促進分散。細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)過(guo)程中需(xu)要(yao)每(mei) 2 到(dao) 3 天(tian)更新壹(yi)次培(pei)養(yang)基(ji)。
1.有(you)關細(xi)胞(bao)傳(chuan)代(dai)培(pei)養(yang)的濃(nong)度，請(qing)參閱(yue)產品(pin)信(xin)息表(biao)。當(dang)確定細胞(bao)已(yi)準(zhun)備(bei)好進行傳代(dai)培(pei)養(yang)時(shi)，繼(ji)續(xu)下壹(yi)步(bu)。
2.取(qu)出並(bing)丟棄(qi)介(jie)質(zhi)。
3.向(xiang)燒(shao)瓶(ping)中加(jia)入 2.0 至 3.0 mL Trypsin-EDTA 溶液，在(zai)倒(dao)置(zhi)顯微(wei)鏡(jing)下觀察細(xi)胞(bao)，直(zhi)至(zhi)細(xi)胞(bao)層(ceng)分散（通常在 5 至 15 分鐘(zhong)內(nei)）。
4.添加(jia) 6.0 至 8.0 mL 的生長培養(yang)基(ji)，並(bing)通過(guo)輕輕(qing)移液(ye)吸出細(xi)胞(bao)。
5.將(jiang)細胞(bao)懸浮液轉(zhuan)移到(dao) 15 mL 離心管(guan)中，並(bing)以大(da)約(yue) 125 xg 的(de)速度旋(xuan)轉(zhuan) 5 至 10 分鐘(zhong)。
6.丟棄(qi)上(shang)清液(ye)並在新鮮(xian)生長培養(yang)基(ji)中重(zhong)懸細(xi)胞(bao)。將(jiang)適當(dang)的細胞(bao)懸浮液等(deng)分試(shi)樣(yang)添(tian)加(jia)到新的細胞(bao)搖(yao)瓶中。
7.有(you)關推(tui)薦(jian)的接種(zhong)濃(nong)度，請(qing)參閱(yue)產品(pin)表(biao)。
五、細胞(bao)凍(dong)存(cun)
在(zai)以下培(pei)養(yang)基(ji)中冷(leng)凍細胞(bao)：95% 生長培養(yang)基(ji)，5% DMSO。將(jiang)小瓶(ping)儲(chu)存(cun)在(zai)液(ye)氮(dan)蒸氣中。避免(mian)將(jiang)小瓶(ping)浸入液氮(dan)中。
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