CRISPR-Cas9基因編輯實(shi)驗中的註意(yi)事(shi)項

在細(xi)胞(bao)上(shang)做(zuo)基因研究的壹(yi)般的過(guo)程(cheng)就(jiu)是(shi)：利(li)用(yong)CRISPR-Cas9先(xian)做(zuo)基因除(chu) (Gene Knockout) ，獲(huo)得(de)基因敲(qiao)除細(xi)胞(bao)系(xi)純(chun)合細(xi)胞(bao)：然(ran)後分析(xi)相(xiang)關(guan)的生(sheng)物(wu)學表型(xing)；最(zui)後做(zuo)為對(dui)照(zhao)還(hai)需要將(jiang)原(yuan)敲(qiao)除的(de)基(ji)因回(hui)補(bu)會(hui)到(dao)原細(xi)胞(bao)系(xi)中(zhong)，做(zuo)為對(dui)照(zhao)細(xi)胞(bao)進行(xing)實(shi)驗(yan)對比(bi)。而(er)利(li)用(yong)Cas9進(jin)行(xing)細(xi)胞(bao)敲(qiao)除之(zhi)後，細(xi)胞(bao)回(hui)補(bu)實驗室(shi)要註意(yi)哪些(xie)問題(ti)? 特別(bie)需要考(kao)慮的技術原(yuan)理是(shi)那些(xie)？如何(he)規劃好(hao)實(shi)驗(yan)流(liu)程(cheng)，下面我們(men)就(jiu)壹步步的(de)進(jin)壹下細(xi)胞(bao)其因敲(qiao)除和回(hui)補(bu)實驗的效率(lv)/價格/周(zhou)期(qi)等(deng)。

壹(yi)、敲(qiao)除細(xi)胞(bao)的方式(shi)

壹(yi)般都是(shi)純(chun)合基因敲(qiao)除細(xi)胞(bao)，當(dang)然(ran)也(ye)可以(yi)選(xuan)擇MixClone的(de)方式(shi)；純(chun)合基因敲(qiao)除，基(ji)本就(jiu)是(shi)目(mu)的(de)基因的(de)所(suo)有的拷(kao)貝都被敲(qiao)除，沒有任何(he)壹(yi)個完整(zheng)的(de)基因拷(kao)貝可以(yi)起(qi)作(zuo)用(yong)；這(zhe)樣的(de)好(hao)處(chu)就(jiu)是(shi)背(bei)景(jing)非常幹凈(jing)，做(zuo)敲(qiao)除最(zui)大的優勢也得(de)以體(ti)現(xian)，缺點就(jiu)是(shi)效(xiao)率(lv)較低(di)，對(dui)細(xi)胞(bao)系(xi)要求(qiu)較高，必(bi)須能夠形(xing)成(cheng)單(dan)克隆(long)MixClone細(xi)胞(bao)敲(qiao)除Cell Pool就(jiu)是(shi)成(cheng)本低(di)，適(shi)合大規模(mo)篩選(xuan)，從整體上(shang)看(kan)生(sheng)物(wu)學表型(xing)的影響(xiang)；缺點就(jiu)是(shi)要看(kan)效果，有很(hen)多(duo)時(shi)候效果遠不(bu)如(ru)純合基因敲(qiao)除，背(bei)景(jing)還(hai)在。

MixClone™極大地簡化(hua)了(le)基(ji)因編輯流(liu)程(cheng)，周期(qi)短(duan)至四(si)周(zhou)，價格只(zhi)有RNA幹擾的壹半(ban)；技(ji)術方(fang)法(fa)和嚴(yan)格的(de)工(gong)藝流(liu)程(cheng)控制(zhi)，基因編輯效(xiao)率(lv)可以(yi)高達(da)80-95%，可直(zhi)接用(yong)於(yu)下遊基因功(gong)能(neng)分析(xi)。

 

MixClone™的(de)技(ji)術流(liu)程(cheng)

二、細(xi)胞(bao)基因敲(qiao)除的(de)方(fang)法(fa)選(xuan)擇

1. 細(xi)胞(bao)基因敲(qiao)除策(ce)略(lve)壹(yi)-移(yi)碼(ma)敲(qiao)除：

優(you)點：設計(ji)簡單(dan)，單(dan)gRNA就(jiu)可以(yi)發揮作用(yong)，成(cheng)本低(di)；
缺點：鑒定(ding)麻煩，需要測(ce)序，難(nan)以保(bao)證壹(yi)個基因有同(tong)樣(yang)基(ji)因型(xing)，所(suo)以(yi)分析(xi)麻(ma)煩(fan)，要保證全(quan)都是(shi)非3的倍(bei)數(shu)的(de)移(yi)碼(ma)才能夠保(bao)證基(ji)因敲(qiao)除，所(suo)有很(hen)多(duo)細(xi)胞(bao)系(xi)是(shi)用(yong)移(yi)碼(ma)做(zuo)不(bu)到(dao)的(基因拷(kao)貝數(shu)多(duo))。

2. 細(xi)胞(bao)基因敲(qiao)除-Cas9X大片段(duan)基(ji)因敲(qiao)除：
優(you)點：鑒定(ding)簡單(dan)，可以(yi)通過(guo)對(dui)敲(qiao)除片(pian)段(duan)外(wai)部設(she)計(ji)primer進行(xing)目(mu)的(de)片段(duan)的(de)擴增，同(tong)時(shi)所(suo)有的基(ji)拷(kao)貝都基本能(neng)夠導(dao)入(ru)壹致(zhi)的基(ji)因缺失(shi)，功(gong)能(neng)分析(xi)簡(jian)單(dan)；

缺點：技術復雜(za)，需要有雙gRNA對(dui)目(mu)的基(ji)因片(pian)段(duan)進(jin)行(xing)切(qie)割(ge)，而(er)且(qie)要中間(jian)片(pian)段(duan)刪(shan)除的克隆(long)，成本高、效率(lv)較低(di)，其(qi)次(ci)需要非常多(duo)的(de)克隆(long)分析(xi)才(cai)能(neng)有結果，需要更多(duo)的(de)篩選(xuan)克隆(long)工作量(liang)。

總結(jie):

移(yi)碼(ma)敲(qiao)除：是(shi)在外(wai)顯(xian)子(zi)上(shang)切壹(yi)下，導致(zhi)非3的堿(jian)基(ji)缺失(shi)或者(zhe)改(gai)變，從而(er)實(shi)現(xian)整(zheng)個外(wai)顯(xian)子(zi)的蛋(dan)白序列的改(gai)變(但是(shi)對(dui)細(xi)胞(bao)有多(duo)染(ran)色(se)體，多(duo)核現象(xiang)的細(xi)胞(bao)，就(jiu)是(shi)多(duo)個基因拷(kao)貝的(de)細(xi)胞(bao)，這(zhe)個基本無(wu)法(fa)去幹凈(jing)) ； 移(yi)碼(ma)的gRNA作用(yong)在外(wai)顯(xian)子(zi)上(shang)！

大片段(duan)敲(qiao)除：就(jiu)是(shi)在內(nei)含(han)子設(she)計(ji)壹對(dui)gRNA，將(jiang)非3整數(shu)的(de)外(wai)顯(xian)子(zi)整個片段(duan)的(de)刪除，或者(zhe)是(shi)整(zheng)個基因片(pian)段(duan)的(de)刪除; (除(chu)了(le)技(ji)術復雜(za)，貴(gui)點，什麽細(xi)胞(bao)系(xi)都能用(yong)) ; gRNA壹(yi)般在內(nei)含(han)子上(shang)切。

三(san)、基因敲(qiao)除細(xi)胞(bao)系(xi)的(de)構建策(ce)略(lve)

1. 通過(guo)病(bing)毒法穩(wen)轉(zhuan)Cas9+gRNA獲(huo)得(de)基因敲(qiao)除細(xi)胞(bao)系(xi)的(de)流程(cheng): 構建載(zai)體(ti)+包病(bing)毒+轉染(ran)+篩選(xuan)+克隆(long)+PCR【持續表(biao)達(da)，周(zhou)期(qi)長(chang)，成本高，效率(lv)高】。

2. 通過(guo)質(zhi)粒法瞬轉Cas9+gRNA獲(huo)得(de)基因敲(qiao)除細(xi)胞(bao)系(xi)的(de)流程(cheng): 構建載(zai)體(ti)+轉染(ran)+克隆(long)+PCR 【階(jie)段(duan)表(biao)達(da)，周(zhou)期(qi)短(duan)，成本低(di)，效(xiao)率(lv)低(di)】。

3. 通過(guo)Cas9X*穩(wen)轉(zhuan)獲(huo)得(de)的基因敲(qiao)除細(xi)胞(bao)系(xi)的(de)流程(cheng): 構建載(zai)體(ti)+轉染(ran)+篩選(xuan)+克隆(long)+PCR【持續表(biao)達(da)，周(zhou)期(qi)短(duan)，成本低(di)，效(xiao)率(lv)高】。

4. 通過(guo)Cas9蛋(dan)白+gRNA獲(huo)得(de)基因敲(qiao)除細(xi)胞(bao)系(xi)的(de)流程(cheng): 轉染(ran)+克隆(long)+PCR【階(jie)段(duan)作(zuo)用(yong)，周(zhou)期(qi)短(duan)，成本高，效率(lv)低(di)】。

總結(jie)可以(yi)分為(wei)兩(liang)類(lei)：持續的(de)表(biao)達(da)Cas9+gRNA與(yu)階(jie)段(duan)性(xing)表(biao)達(da)Cas9+gRNA兩(liang)種(zhong)。

四(si)、基因回(hui)補(bu)實驗的需要特別(bie)註意(yi)的(de)問題(ti)
1. 壹般都是(shi)cDNA的(de)回(hui)補(bu)99%都是(shi)用(yong)cDNA來做(zuo)回(hui)補(bu)，除非有錢的(de)可以(yi)使(shi)用(yong)BAC大片段(duan)來做(zuo)回(hui)補(bu)的 (可以(yi)考(kao)慮壹下我們(men)的(de)VIRUS-Free技(ji)術)。

2. cDNA會(hui)不(bu)會(hui)被gRNA識別切割(ge)? 如果是(shi)Cas9持續表(biao)達(da)的(de)，而(er)且(qie)gRNA是(shi)作(zuo)用(yong)在外(wai)顯(xian)子(zi)的肯定(ding)會(hui)!所(suo)以(yi)要特別(bie)註意(yi)做(zuo)回(hui)補(bu)的時(shi)候，移(yi)碼(ma)突變的必(bi)須要做(zuo)cDNA突變(就(jiu)是(shi)同(tong)義(yi)突變，將(jiang)CRISPR識(shi)別(bie)的PAM序列去掉才行(xing));要不(bu)回(hui)補(bu)的CDNA也會(hui)被切割(ge)破壞掉，所(suo)以(yi)我們(men)不(bu)推(tui)薦做(zuo)移(yi)碼(ma)敲(qiao)除是(shi)有原因的(de)，前(qian)面省的(de)錢(qian)後面再(zai)花回(hui)去。[註意(yi)：之(zhi)前(qian)報道Cas9是(shi)可以(yi)編輯mRNA的(de)，所(suo)以(yi)......移(yi)碼(ma)除技術的(de)問題(ti)後面比(bi)較(jiao)復雜(za)，很(hen)多(duo)人(ren)做(zuo)回(hui)補(bu)實驗沒有檢測(ce)到，這(zhe)個也是(shi)其(qi)中(zhong)原因之(zhi)壹(yi)]

Cas9X的所(suo)有大片段(duan)敲(qiao)除的(de)切(qie)割(ge)在內(nei)含(han)子上(shang)，壹般沒有在cDNA上(shang)面有識別(bie)切(qie)割(ge)位(wei)點，所(suo)以(yi)回(hui)補(bu)實驗就(jiu)簡單(dan)很(hen)多(duo)!

除(chu)此(ci)之(zhi)外(wai)，Cas9X的(de)核心技術還(hai)具(ju)備(bei)“0"偏差的(de)將(jiang)Cas9模(mo)塊(kuai)移(yi)除(chu)，有需要的科(ke)學家(jia)可以(yi)向(xiang)我們(men)提(ti)出，我們(men)可以(yi)將(jiang)Cas9模(mo)塊(kuai)在交(jiao)付(fu)的敲(qiao)除細(xi)胞(bao)株裏面移(yi)除(chu)。是(shi)不(bu)是(shi)就(jiu)更加的(de)放心了(le)?

3. 回(hui)補(bu)的鑒定(ding)問題(ti)?

要特別(bie)註意(yi)移(yi)碼(ma)突變的過(guo)程(cheng)中，有壹定(ding)概(gai)率(lv)出現的WB背景(jing)雜帶的問題(ti)比(bi)較(jiao)麻(ma)煩(fan)? 回(hui)補(bu)之(zhi)後的序列可能(neng)會(hui)幹擾到回(hui)補(bu)片段(duan)的(de)表達(da)鑒定(ding)。

    蘇州阿(e)爾(er)法(fa)生(sheng)物(wu)提供HyCyte™ 幹細(xi)胞(bao)、原代(dai)細(xi)胞(bao)、細(xi)胞(bao)株、三(san)系(xi)誘導培養試劑、ClonePlus™ 專(zhuan)用(yong)培養基(ji)、基因編輯試劑盒、細(xi)胞(bao)、胎(tai)牛血清(qing) 等(deng)細(xi)胞(bao)培養試劑。
 
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