使用ipsc誘(you)導多能幹細胞生(sheng)成(cheng)類器官(guan)技(ji)術(shu)簡(jian)介

類器官(guan)是(shi)復雜(za)的 3-D 器(qi)官(guan)樣(yang)微組織(zhi)，由多(duo)種分化(hua)的細胞類型(xing)組成(cheng)，其(qi)結(jie)構(gou)組(zu)織(zhi)類似於體(ti)內(nei)發(fa)現(xian)的細胞，具(ju)有(you)中(zhong)央(yang)腔(qiang)和其(qi)他類似體(ti)內(nei)的結(jie)構(gou)特(te)征(zheng)。從ipsc誘(you)導多能幹細胞 產(chan)生(sheng)的類器官(guan)已被描述(shu)用於胃、腸(chang)、肺(fei)、大腦、腎、肝(gan)臟等各種組織(zhi)，這些(xie)類器官(guan)是(shi)其(qi)他體(ti)外(wai)模型(xing)的有(you)吸引(yin)力的替(ti)代(dai)品(pin)；這些(xie)微組織(zhi)比 2-D 細胞培(pei)養或簡(jian)單(dan)的 3-D 球體(ti)聚集體(ti)更(geng)好(hao)地概(gai)括(kuo)了體(ti)內(nei)組(zu)織(zhi)表型(xing)，但沒(mei)有與(yu)器官(guan)外(wai)植(zhi)體(ti)或(huo)組(zu)織(zhi)切片(pian)相關(guan)的挑戰，例(li)如(ru)培(pei)養壽命有限。事(shi)實上，類器官(guan)保(bao)留(liu)了許(xu)多細胞培(pei)養的典(dian)型(xing)有利(li)特征(zheng)，例(li)如(ru)維持(chi)穩(wen)定(ding)培養數月(yue)的能(neng)力，以(yi)及冷(leng)凍保存(cun)和恢(hui)復培(pei)養物(wu)的能(neng)力。類器官(guan)也(ye)適用於許(xu)多標準(zhun)實驗室(shi)技術，包(bao)括(kuo)使用 CRISPR/Cas9 進(jin)行(xing)基因(yin)修(xiu)飾(shi)、免(mian)疫(yi)熒光(guang)染色、RNA 表(biao)達定(ding)量(liang)、蛋(dan)白(bai)質(zhi)印(yin)跡(ji)和毒(du)性測定(ding)。類器官(guan)培(pei)養物(wu)已被用於基(ji)礎研究(jiu)和轉化(hua)研究(jiu)。例(li)如(ru)，腸(chang)道類器官(guan)已被證(zheng)明(ming)可(ke)在(zai)體(ti)內(nei)植(zhi)入(ru)，用作囊(nang)性(xing)纖維化(hua)模型(xing)使用來源的肺(fei) iPSC，並(bing)探(tan)索宿主與細菌(jun)與沙(sha)門氏(shi)菌(jun)的相互(hu)作用。 腎臟類器官(guan)已用於研究(jiu)腎毒性(xing)，胃類器官(guan)被證(zheng)明(ming)是(shi)幽(you)門螺(luo)桿(gan)菌(jun)感染的合(he)適模型(xing)。在這(zhe)裏(li)，我們(men)簡要介紹了壹種，用於在(zai)特定(ding)培養基中(zhong)結(jie)合(he)使(shi)用 2-D 和 3-D 培(pei)養的方(fang)式從三個 人(ren)類 iPSC 細胞系(xi)（ 生(sheng)成(cheng)胃腸(chang)道 (GI) 類器官(guan)。
ipsc誘(you)導多能幹細胞 誘(you)導分化(hua)培(pei)養
簡而(er)言(yan)之(zhi)，使用多能(neng)幹細胞培(pei)養基在(zai)無(wu)飼養層(ceng)和無(wu)血清(qing)條件下將(jiang)iPSC 維持(chi)在(zai)  細胞基(ji)底(di)膜包被的培(pei)養皿(min)上。每天(tian)更換(huan)培養基。在(zai)常(chang)規 iPSC 培(pei)養過程(cheng)中(zhong)，細胞每 3-5 天(tian)使用幹細胞解離試劑(ji)傳(chuan)代(dai)壹(yi)次，並作為(wei)小(xiao)聚集體(ti)接(jie)種(zhong)。對於(yu)類器官(guan)的生(sheng)成(cheng)，使(shi)用了未(wei)顯示自發(fa)分化(hua)跡(ji)象(xiang)的低(di)傳(chuan)代(dai) iPSC。


iPSC 誘(you)導分化(hua)步(bu)驟：
壹(yi)、定(ding)形(xing)內胚(pei)層(ceng)分化(hua)
根(gen)據說(shuo)明(ming)書重構所(suo)有利基(ji)因(yin)子(zi)，並在(zai) -80°C 下作為(wei)壹(yi)次性等分試樣(yang)儲(chu)存(cun)。iPSC 被接種(zhong)到(dao) Cell Basement 包被的 24 孔多孔板(ban)中(zhong)，並(bing)生(sheng)長(chang)至(zhi) 30-50% 的匯(hui)合度(du)。B27 補充劑(ji) 和 100 ng/mL 激(ji)活(huo)素(su) A 組成(cheng)的定(ding)形(xing)內胚(pei)層(ceng) (DE) 分化(hua)培(pei)養基替(ti)換(huan)培養基三天(tian)。第壹天(tian)，DE 培養基還(hai)含有 2 µM CHIR99021。培(pei)養基是(shi)新鮮(xian)的並(bing)且每天(tian)更換(huan)三天(tian)。
二、後腸(chang)球體(ti)生(sheng)成(cheng)
在(zai) DE 誘(you)導後，通過在 RPMI-1640、B27、100 ng/mL 激(ji)活(huo)素(su) A、3 µM CHIR99021 和 500 ng/mL 成(cheng)纖(xian)維細胞生(sheng)長(chang)因(yin)子(zi) 4（FGF4）中(zhong)培(pei)養四天(tian)，生(sheng)成(cheng)中(zhong)/後(hou)腸(chang)球體(ti)。媒體(ti)是(shi)新鮮(xian)的，每天(tian)都在變(bian)化(hua)。
三、後前(qian)腸(chang)球體(ti)生(sheng)成(cheng)
在(zai) DE 誘(you)導後，通過在 RPMI-1640、B27、2 µM CHIR99021、500 ng/mL FGF4 和 200 ng/mL noggin 中(zhong)培(pei)養三天(tian)，生(sheng)成(cheng)後(hou)前(qian)腸(chang)球體(ti)。第壹天(tian)，培養基還(hai)含有 2 µM 視(shi)黃(huang)酸 。每天(tian)更換(huan)媒體(ti)。媒體(ti)每天(tian)都是(shi)新鮮(xian)的。
四、腸(chang)道類器官(guan)生(sheng)成(cheng)
收(shou)集(ji)中(zhong)/後(hou)腸(chang)球體(ti)並(bing)重新懸浮(fu)在(zai)冰冷(leng)、未(wei)稀(xi)釋(shi)的細胞基(ji)底(di)中(zhong)。大約 10-20 個(ge)球體(ti)被鍍在(zai) 24 孔板(ban)的每個孔中(zhong)，每滴 50 μL。鋪板(ban)後，將(jiang)板(ban)在 37°C 下保持(chi) 15 分鐘以(yi)使(shi)凝(ning)膠聚合，在孔中(zhong)心形(xing)成(cheng) 3-D 圓(yuan)頂。凝(ning)固的凝(ning)膠覆(fu)蓋有預熱(re)的完(wan)整(zheng)腸(chang)道類器官(guan)培(pei)養基，該(gai)培(pei)養基由(you) Advanced DMEM:F12、N2 補(bu)充劑 、B27 補(bu)充(chong)劑(ji)、L-谷氨酰(xian)胺(an)、10 mM HEPES 、100 ng/mL 表(biao)皮生(sheng)長(chang)因(yin)子(zi)（EGF）、100 ng/mL noggin和 500 ng/mL R-spondin-1。每 3-4 天(tian)更換(huan)壹次培養基，每 7-14 天(tian)通過機械(xie)解離將(jiang)類器官(guan)傳(chuan)代(dai)到(dao)新鮮(xian)的細胞基(ji)底(di)中(zhong)。完(wan)整(zheng)培(pei)養基在(zai) 4°C 下儲(chu)存(cun)不(bu)超(chao)過三天(tian)。
五、胃類器官(guan)生(sheng)成(cheng)
收(shou)集(ji)後(hou)部前(qian)腸(chang)球體(ti)並(bing)重新懸浮(fu)在(zai)未(wei)稀(xi)釋(shi)的細胞基(ji)底(di)中(zhong)。大約 10-20 個(ge)球體(ti)被鍍在(zai) 24 孔板(ban)的每個孔中(zhong)，每滴 50 μL。接種(zhong)後(hou)，將(jiang)板(ban)在 37°C 下保持(chi) 15 分鐘以(yi)聚合凝(ning)膠，在孔中(zhong)心形(xing)成(cheng) 3-D 圓(yuan)頂。凝(ning)固的凝(ning)膠覆(fu)蓋有預熱(re)的完(wan)整(zheng)胃類器官(guan)培(pei)養基，包(bao)括(kuo)高(gao)級 DMEM：F12、N2 補充劑、B27 補(bu)充(chong)劑(ji)、L-谷氨(an)酰胺(an)、10 mM HEPES、100 ng/mL EGF、200 ng/mL noggin 和 2 µM 視(shi)黃酸(suan)酸(suan)。每 3-4 天(tian)更換(huan)壹次培養基，每 7-10 天(tian)將(jiang)類器官(guan)嵌入(ru)新鮮的細胞基(ji)底(di)中(zhong)。完(wan)整(zheng)培(pei)養基在(zai) 4°C 下儲(chu)存(cun)不(bu)超(chao)過三天(tian)。
六、免(mian)疫(yi)熒光(guang)和免(mian)疫(yi)組織(zhi)化(hua)學
細胞單(dan)層(ceng)、球體(ti)或(huo)組(zu)織(zhi)在 PBS磷(lin)酸鹽緩(huan)沖(chong)液(ye)中(zhong)洗(xi)滌兩(liang)次， 並(bing)在室(shi)溫(wen)下固定(ding)在 4% 多(duo)聚甲(jia)醛中(zhong) 15 至(zhi) 30 分鐘。固定(ding)的球體(ti)/類器官(guan)被包埋在(zai)石(shi)蠟中(zhong)，以(yi) 5-10 µm 切片(pian)，並安裝(zhuang)在(zai)幻(huan)燈片(pian)上用於後(hou)續染色。對於(yu)免(mian)疫(yi)熒光(guang)染色，細胞單(dan)層(ceng)或組(zu)織(zhi)切片(pian)在含有 5% 驢(lv)血清(qing)、0.5% Triton-X、0.2% Tween-20 和 1% 牛(niu)血清(qing)白(bai)蛋(dan)白(bai)的 PBS 中(zhong)在(zai)室溫(wen)下封閉(bi)和透(tou)化(hua) 1 小(xiao)時(shi)。壹(yi)抗在(zai)封閉緩(huan)沖(chong)液(ye)中(zhong)稀(xi)釋(shi)，並在(zai) 4°C 下與細胞壹(yi)起(qi)孵育過夜。熒光(guang)二抗在(zai)封閉緩(huan)沖(chong)液(ye)中(zhong)稀(xi)釋(shi)，並與(yu)細胞在(zai)室(shi)溫(wen)下避光(guang)孵育 1 小時。使(shi)用蘇(su)木精、曙紅和 PAS-Alcian Blue 進(jin)行(xing)組織(zhi)學染色。 
總(zong)結(jie)
 在(zai)體(ti)內(nei)，DE 產(chan)生(sheng)消化(hua)道，是(shi) GI 類器官(guan)發(fa)育過程(cheng)中(zhong)關(guan)鍵(jian)的第壹步(bu)。免(mian)疫(yi)染色顯示，在(zai) DE 分化(hua)培(pei)養基中(zhong)三天(tian)後，特(te)征(zheng)性 DE 標記物(wu) FOXA2 和 SOX17 的表(biao)達超(chao)過 80%，並且(qie)中(zhong)胚(pei)層(ceng)標記物(wu) brachyury（數(shu)據未(wei)顯示）的表(biao)達較小。

   在前(qian)腸(chang)或後腸(chang)分化(hua)培(pei)養基中(zhong) 3 至(zhi) 4 天(tian)後，形(xing)成(cheng)漂(piao)浮(fu)或(huo)半粘附的球體(ti)以(yi)及粘附的細長(chang)管狀結(jie)構(gou)。後(hou)腸(chang)分化(hua)培(pei)養基產(chan)生(sheng)的球體(ti)對腸(chang)道標記物(wu) CDX2 呈(cheng)陽(yang)性，但(dan)對後(hou)腸(chang)標記物(wu) SOX2 呈(cheng)陰性，而(er)前(qian)腸(chang)分化(hua)培(pei)養基產(chan)生(sheng)的球體(ti)為(wei) CDX2-/SOX2+。
在(zai)球體(ti)嵌入(ru) ATCC 細胞基(ji)底(di)膜並保(bao)存(cun)在(zai)類器官(guan)生(sheng)成(cheng)培(pei)養基中(zhong)後(hou)的 7 天(tian)內，大的簡(jian)單圓(yuan)形(xing)類器官(guan)變(bian)得可見(jian)，直(zhi)徑(jing)約為(wei) 100-200 µm。到(dao)第 30 天(tian)時，類器官(guan)的大小和復雜(za)性大大增加，直(zhi)徑(jing)為(wei) 1500-2000 µm，並(bing)且有許(xu)多可見的管(guan)狀和隱窩/芽狀結(jie)構(gou)。
    30 天(tian)以上(shang)類器官(guan)的免(mian)疫(yi)染色顯示復雜(za)的折(zhe)疊(die)結(jie)構(gou)、柱狀上皮(pi)、隱窩樣(yang)結(jie)構(gou)和許(xu)多胃腸(chang)道標誌物(wu)的表(biao)達，包括(kuo)前(qian)腸(chang)標誌物(wu) PDX1、後(hou)腸(chang)標誌物(wu) CDX1、MUC1 和 MUC5AC 陽(yang)性粘(zhan)蛋(dan)白(bai)分泌細胞、溶菌(jun)酶(mei) (LYSO) - 陽(yang)性潘氏(shi)細胞和絨毛(mao)蛋(dan)白(bai) (VILL) 陽(yang)性腸(chang)細胞。類器官(guan)周圍(wei)的細胞包(bao)含異(yi)質(zhi)細胞群(qun)，這(zhe)些細胞表(biao)達波形(xing)蛋(dan)白(bai) (VIM)、纖連(lian)蛋(dan)白(bai)和平(ping)滑(hua)肌α肌動(dong)蛋(dan)白(bai) (α-SMA)。粘蛋(dan)白(bai)表達僅(jin)限於(yu)杯(bei)狀細胞和類器官(guan)的中(zhong)央(yang)腔(qiang)，其(qi)中(zhong)還(hai)含有死細胞和碎(sui)片(pian). 用 H&E 和 PAS-Alcian Blue 進(jin)行(xing)的組(zu)織(zhi)學染色顯示存(cun)在(zai)酸(suan)性(xing)和中(zhong)性(xing)粘蛋(dan)白(bai)，以及成(cheng)熟(shu)類器官(guan)內(nei)的組(zu)織(zhi)樣(yang)形(xing)態(tai)。

與簡(jian)單(dan)的 3-D 球體(ti)或(huo)傳(chuan)統的 2-D 培(pei)養模型(xing)相比，類器官(guan)可(ke)以(yi)更(geng)忠實地再(zai)現(xian)復雜(za)的生(sheng)理(li)結(jie)構(gou)。然而(er)，類器官(guan)並(bing)非沒有局(ju)限性(xing)。雖(sui)然 iPSC 衍生(sheng)的 GI 類器官(guan)表(biao)現(xian)出體(ti)內(nei)組(zu)織(zhi)的許(xu)多特征(zheng)，但它們不(bu)能捕(bu)捉(zhuo)成(cheng)熟(shu)組(zu)織(zhi)的表(biao)型(xing)。例(li)如(ru)，它們缺乏(fa)體(ti)內(nei)組(zu)織(zhi)的許(xu)多方面(mian)，例(li)如(ru)脈(mai)管(guan)系(xi)統以及與神經(jing)和免(mian)疫(yi)系(xi)統的相互(hu)作用。此外(wai)，雖然類器官(guan)在(zai)體(ti)內(nei)顯示出(chu)類似細胞的組(zu)織(zhi)結(jie)構(gou)，但(dan)它與原(yuan)代(dai)胃腸(chang)道組織(zhi)中(zhong)的組(zu)織(zhi)結(jie)構(gou)並(bing)不(bu)壹致，而(er)且任(ren)何單個(ge)類器官(guan)的大小、復雜(za)性、活(huo)力和特(te)定(ding)細胞類型(xing)的表(biao)達都可能(neng)存(cun)在(zai)顯著(zhe)差(cha)異(yi)。雖然用於生(sheng)成(cheng)類器官(guan)的分化(hua)培(pei)養基可(ke)能(neng)是(shi)定(ding)義的，但(dan)大多數(shu)類器依賴於(yu)未(wei)定(ding)義的、小(xiao)鼠來源的細胞外(wai)基質(zhi)，這(zhe)限制(zhi)了它們的臨(lin)床應(ying)用。盡(jin)管存(cun)在(zai)這(zhe)些(xie)挑戰，類器官(guan)培(pei)養方法仍然是(shi)壹種(zhong)有用的工(gong)具(ju)，可(ke)以增加我們(men)對器(qi)官(guan)發(fa)育的理(li)解，並為藥(yao)物(wu)篩(shai)選(xuan)或再(zai)生(sheng)醫(yi)學等個性化(hua)醫(yi)學方(fang)法帶來希望。
類器官(guan)的產(chan)生(sheng)嚴(yan)重依賴(lai)於(yu)各(ge)種利基(ji)因(yin)素(su)的貢(gong)獻和特(te)定(ding)組織(zhi)適當(dang)信(xin)號通路(lu)的暫(zan)時受(shou)限激(ji)活(huo)。我們(men)發(fa)現(xian)實驗中(zhong)中(zhong)使(shi)用的許(xu)多重組蛋(dan)白(bai)和小(xiao)分子(zi)的活(huo)性存(cun)在(zai)顯著(zhe)的批(pi)次間和供應(ying)商間(jian)差異(yi)。類器官(guan)的生(sheng)成(cheng)依(yi)賴(lai)於(yu)壹系(xi)列(lie)特(te)定(ding)的發(fa)育事件，這(zhe)些(xie)事(shi)件(jian)嚴重依賴(lai)於(yu)先(xian)前(qian)的階(jie)段。特(te)別是(shi)，如(ru)果iPSC 的 DE 形(xing)成(cheng)的初(chu)始(shi)步驟不(bu)是(shi) 80-90%，我們(men)發(fa)現(xian)類器官(guan)生(sheng)成(cheng)通常(chang)不(bu)成(cheng)功(gong)。另(ling)外(wai)，壹些(xie)分化(hua)標記在類器官(guan)達到(dao)壹定(ding)的成(cheng)熟(shu)階(jie)段(duan)之前(qian)並(bing)不(bu)明(ming)顯；我們(men)建議(yi)將(jiang) GI 類器官(guan)培(pei)養至(zhi)少 30 天(tian)，在某(mou)些情況下，可能(neng)需要 60 天(tian)以上(shang)才(cai)能出(chu)現(xian)完(wan)整(zheng)的細胞類型(xing)。
     
     蘇(su)州(zhou)阿(e)爾(er)法生(sheng)物(wu)提(ti)供的ipsc誘(you)導多能幹細胞、誘(you)導分化(hua)幹(gan)細胞、骨髓幹細胞、幹(gan)細胞誘(you)導分化(hua)培(pei)養基等廣泛應(ying)用於類器官(guan)生(sheng)成(cheng)，組(zu)織(zhi)形(xing)成(cheng)等領域(yu)。更(geng)多細胞生(sheng)物(wu)學、幹(gan)細胞相關(guan)內(nei)容(rong) 進(jin)入(ru)網站(zhan)了解。