流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)技術(shu)介(jie)紹(shao)

  流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)技術(shu)是(shi)壹(yi)項廣(guang)為使用(yong)、基於(yu)激(ji)光(guang)的(de)生(sheng)物學技術(shu)，利(li)用流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)儀對處於 快(kuai)速(su)流(liu)動的(de)熒光(guang)染色的(de)細(xi)胞(bao)或(huo)生物(wu)顆粒進行多(duo)參數(shu)、快速(su)的(de)定(ding)量(liang)分(fen)析和(he)分(fen)選，是(shi)當(dang)代主要的(de)細(xi)胞(bao)定(ding)量(liang)分(fen)析技(ji)術(shu)之(zhi)壹。主要有以(yi)下(xia)幾(ji)個(ge)特點(dian)：
1.只(zhi)要樣(yang)本(ben)制成(cheng)單(dan)個細(xi)胞(bao)或(huo)生物(wu)顆粒懸液均(jun)可(ke)以(yi)分(fen)析。
2.測(ce)量(liang)速(su)度快(kuai)，每秒鐘可(ke)以(yi)測(ce)量(liang)數(shu)千(qian)個乃(nai)至(zhi)數萬(wan)個(ge)細(xi)胞(bao)
3.同時測(ce)量(liang)每個細(xi)胞(bao)的(de)多(duo)參數(shu)特征(zheng)。
4.在(zai)進(jin)行細(xi)胞(bao)特征(zheng)分(fen)析的(de)同(tong)時可(ke)以(yi)把(ba)有(you)特征(zheng)細(xi)胞(bao)分(fen)離出(chu)來(lai)(分(fen)選技(ji)術(shu))
關(guan)於(yu)流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)儀
流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)儀由三部分(fen)構成(cheng)——
1.液(ye)流(liu)系統(tong)，包(bao)括(kuo)流(liu)動室和液(ye)流(liu)驅(qu)動(dong)系統(tong)；
2.光學系統(tong)，包(bao)括(kuo)激(ji)發(fa)光(guang)源(yuan)和(he)光(guang)束(shu)收(shou)集(ji)系(xi)統(tong)；
3.電(dian)子(zi)系(xi)統(tong)，包(bao)括(kuo)光(guang)電(dian)轉換器和(he)數據(ju)處理系(xi)統(tong)。

流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)儀工作(zuo)原(yuan)理
流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)儀的(de)工作(zuo)原(yuan)理是(shi)使(shi)懸浮(fu)在(zai)液體中分(fen)散(san)的(de)經熒光(guang)標記的(de)細(xi)胞(bao)或(huo)微粒(li)逐個(ge) 通過樣(yang)品(pin)池，同時(shi)由熒光(guang)探(tan)測(ce)器捕(bu)獲熒光(guang)信(xin)號並轉換成(cheng)分(fen)別代表(biao)前(qian)向散(san)射(she)角(jiao)、側(ce) 向(xiang)散(san)射(she)角(jiao)和(he)不同熒光(guang)強(qiang)度的(de)電(dian)脈(mai)沖(chong)信號，經計算機處理形成(cheng)相(xiang)應的(de)點(dian)圖，直(zhi)方圖(tu)和加(jia)三維(wei)結(jie)構(gou)圖(tu)像進行分(fen)析。
目前(qian)臨床中運用(yong)流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)儀進行外(wai)周(zhou)血(xue)白(bai)細(xi)胞(bao)、骨(gu)髓細(xi)胞(bao)以(yi)及(ji)腫瘤細(xi)胞(bao)等的(de)檢(jian)測(ce)，是(shi)臨床檢(jian)測(ce)的(de)重(zhong)要組成(cheng)部分(fen)。

流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)術(shu)基本(ben)原則
1.使(shi)各種液(ye)體和懸浮(fu)細(xi)胞(bao)樣(yang)本(ben)新(xin)鮮(xian)，盡(jin)快完(wan)成(cheng)樣(yang)本(ben)制備和檢(jian)測(ce)；
2.針(zhen)對(dui)不同的(de)細(xi)胞(bao)樣(yang)本(ben)進行適(shi)當(dang)洗(xi)滌(di)、酶(mei)消(xiao)化或(huo) EDTA 處理，以(yi)清(qing)除(chu)雜(za)質，使粘(zhan)附的(de)細(xi)胞(bao)彼此分(fen)離而形成(cheng)單(dan)細(xi)胞(bao)狀(zhuang)態(tai)；
3.對(dui)新(xin)鮮(xian)實(shi)體瘤組織可(ke)選用(yong)或(huo)聯用(yong)酶消(xiao)化法，機(ji)械(xie)打(da)散(san)法(fa)和化學分(fen)散(san)法(fa)來獲得(de)足夠數量(liang)的(de)單(dan)細(xi)胞(bao)懸液；
4.對石(shi)蠟(la)包(bao)埋組織應先切成(cheng)若(ruo)幹40-50um 厚的(de)蠟(la)片，經二(er)甲(jia)苯(ben)脫(tuo)蠟(la)到(dao)水(shui)後，再(zai)用(yong)前(qian)述(shu)方法(fa)制備單(dan)細(xi)胞(bao)懸液；
5.單(dan)細(xi)胞(bao)懸液的(de)細(xi)胞(bao)數不應少(shao)於(yu)10000個(ge)。 
 
實(shi)驗(yan)步(bu)驟
1.制備單(dan)細(xi)胞(bao)懸液
將(jiang)待(dai)測(ce)細(xi)胞(bao)或(huo)微粒(li)制成(cheng)單(dan)細(xi)胞(bao)懸液，經特異(yi)性(xing)熒光(guang)染料標記抗(kang)體進行染色。在恒(heng) 定(ding)氣體的(de)壓力下(xia)進(jin)入(ru)流(liu)動室，不含細(xi)胞(bao)或(huo)微粒(li)的(de)緩(huan)沖(chong)液在高壓下(xia)從(cong)鞘(qiao)液管噴出。 鞘(qiao)液管入(ru)口(kou)方向與待(dai)測(ce)樣(yang)品(pin)流(liu)形成(cheng)壹(yi)定(ding)角(jiao)度，鞘(qiao)液包(bao)繞著樣(yang)品(pin)高(gao)速(su)流(liu)動，組成(cheng)壹(yi)個圓柱形的(de)液(ye)流(liu)束(shu)。待(dai)測(ce)細(xi)胞(bao)或(huo)微粒(li)在鞘(qiao)液的(de)包(bao)被(bei)下(xia)單(dan)行排列(lie)，依(yi)冷(leng)通(tong)過檢(jian)測(ce)區(qu)域(yu)。
2.其次，收集(ji)單(dan)細(xi)胞(bao)上的(de)熒光(guang)信(xin)號
流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)儀通常以(yi)激(ji)光(guang)作(zuo)為發光(guang)源(yuan)，經過聚(ju)焦整形後(hou)的(de)光(guang)束(shu)垂直(zhi)照射(she)在(zai)樣(yang)品(pin)流(liu) 上，細(xi)胞(bao)或(huo)微粒(li)上的(de)熒光(guang)染料被激(ji)發(fa)，產(chan)生(sheng)散(san)射(she)光(guang)和(he)激(ji)發(fa)熒光(guang)。光(guang)散(san)射(she)信(xin)號在前(qian) 向小(xiao)角(jiao)度進(jin)行檢(jian)測(ce)，這(zhe)種(zhong)信號基本(ben)上反映(ying)了(le)細(xi)胞(bao)體積的(de)大小；熒光(guang)信(xin)號的(de)接(jie)受方(fang) 向(xiang)與激(ji)光(guang)束(shu)垂直(zhi)，經過壹(yi)系(xi)列(lie)雙(shuang)色性(xing)反(fan)射(she)鏡(jing)和帶(dai)通濾光片的(de)分(fen)離，形成(cheng)多(duo)個不同波長(chang)的(de)熒光(guang)信(xin)號。
3.再次，統(tong)計結(jie)果(guo)
熒光(guang)信(xin)號的(de)強(qiang)度代表(biao)了(le)所(suo)測(ce)細(xi)胞(bao)膜表面抗(kang)原(yuan)強(qiang)度或(huo)細(xi)胞(bao)內物質的(de)濃度，經光電(dian)轉 換變為可(ke)被計(ji)算機識(shi)別的(de)數(shu)字(zi)信號。計算機把(ba)所(suo)測(ce)量(liang)到(dao)的(de)各種信(xin)號進行計(ji)算機處
理，將(jiang)分(fen)析結(jie)果(guo)顯(xian)示在計(ji)算機上(shang)。
4.最後(hou)，做細(xi)胞(bao)分(fen)選
細(xi)胞(bao)的(de)分(fen)選是(shi)指(zhi)根據(ju)所(suo)測(ce)定(ding)的(de)各個參數(shu)將(jiang)細(xi)胞(bao)從細(xi)胞(bao)群體中分(fen)離出(chu)來(lai)的(de) 壹(yi)種方(fang)式(shi)，通過(guo)分(fen)離含有(you)單(dan)細(xi)胞(bao)的(de)液(ye)滴實(shi)現(xian)。在流(liu)動室的(de)噴口上(shang)方配有壹(yi)個超(chao)高頻的(de)壓電(dian)晶體，產生的(de)振(zhen)動(dong)使噴出的(de)液(ye)流(liu)形成(cheng)均(jun)勻的(de)液(ye)滴，待(dai)測(ce)細(xi)胞(bao)就(jiu)分(fen)散(san)在(zai)這(zhe)些(xie)液(ye)滴之(zhi)中。將(jiang)這(zhe)些(xie)液(ye)滴充(chong)以(yi)正(zheng)負不同的(de)電(dian)荷(he)，當(dang)液(ye)滴流(liu)經帶(dai)有幾(ji)千(qian)伏(fu)特的(de)偏轉板時(shi)，在(zai)高壓電(dian)場(chang)的(de)作(zuo)用下(xia)偏轉，落(luo)入(ru)各自的(de)收(shou)集容(rong)器中，不予充電(dian)的(de)液(ye)滴落(luo)入(ru)中間(jian)的(de)廢(fei)液(ye)容(rong)器，從(cong)而實現(xian)細(xi)胞(bao)的(de)分(fen)離。 
流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)技術(shu)的(de)應用
1.其測(ce)定(ding)細(xi)胞(bao)內DNA 的(de)變異(yi)系數(shu)最小(xiao)， 壹(yi)般(ban)在(zai)2%以(yi)下(xia)；
2.能(neng)準(zhun)確(que)地進行DNA 倍(bei)體分(fen)析；
3.借(jie)助於熒光(guang)染料進行細(xi)胞(bao)內蛋白(bai)質和核酸的(de)定(ding)量(liang)研究(jiu)；
4.快(kuai)速(su)進行細(xi)胞(bao)分(fen)選和(he)細(xi)胞(bao)收集；
5.醫學應用：免(mian)疫(yi)功能(neng)研究(jiu)各種幹(gan)細(xi)胞(bao)的(de)檢(jian)測(ce)，癌(ai)癥(zheng)病(bing)人的(de)多(duo)藥耐(nai)藥性(xing)，細(xi)胞(bao)功能(neng) 及(ji)代謝(xie)動力學研究(jiu)，血(xue)小板分(fen)析(心(xin)血(xue)管疾病(bing)),流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)術(shu)與分(fen)子(zi)生(sheng)物(wu)學研究(jiu)；
6.應用於(yu)外(wai)周(zhou)血(xue)內皮細(xi)胞(bao)測(ce)定(ding)、調(tiao)節性(xing)T 細(xi)胞(bao)等領域(yu)。
 
流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)儀的(de)應用
(壹(yi))、檢(jian)測(ce)細(xi)胞(bao)雕亡
1.亞 G1 峰檢(jian)測(ce)：雕亡細(xi)胞(bao)雙鏈 DNA 發生(sheng)裂解導致染色質濃集(ji)。 DNA 降(jiang)解後，形
成(cheng)長(chang)度為180-200bp 的(de) DNA 片(pian)段，成(cheng)為雕亡小(xiao)體。而常規(gui)壞(huai)死的(de)DNA 分(fen)解是(shi)隨機的(de)， DNA 片(pian)段大小不壹，在流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)檢(jian)測(ce)上(shang)可(ke)出現(xian)比(bi)亞二(er)倍(bei)體 (G1) 峰更小(xiao)的(de)細(xi)胞(bao)碎片(pian)峰。
2.Annexin V/PI雙染色法：當(dang)細(xi)胞(bao)發生雕亡時(shi)， PS (磷酯(zhi)酰絲(si)氨酸)從(cong)細(xi)胞(bao)膜內 轉移到(dao)細(xi)胞(bao)膜外，使 PS 暴(bao)露(lu)在細(xi)胞(bao)膜表面， Annexin V 具(ju)有(you)易於結(jie)合 PS 的(de)磷(lin) 脂(zhi)結合蛋(dan)白(bai)。因(yin)此，建(jian)立(li)壹種(zhong)用(yong)Annexin V結合在(zai)細(xi)胞(bao)膜表面作(zuo)為雕亡的(de)指(zhi)標並 結(jie)合壹(yi)種(zhong)染料排出試驗(yan)已檢(jian)測(ce)細(xi)胞(bao)膜的(de)完(wan)整性(xing)的(de)檢(jian)測(ce)方(fang)法(fa)。該(gai)法使用 FITC 標記AnnexinV, 同時結合使(shi)用(yong)PI標記細(xi)胞(bao)核。
3.JC-1 染色法檢(jian)測(ce)線粒體膜電(dian)位： JC-1 有單(dan)體和多聚體兩種存(cun)在(zai)狀(zhuang)態(tai)。低(di)濃度 時(shi)，以(yi)單(dan)體存(cun)在(zai)，可(ke)檢(jian)測(ce)到(dao)綠(lv)色熒。,用(yong)流(liu)式(shi)檢(jian)測(ce)時(shi)，通(tong)常為 FL-1 通道。高(gao)濃度 時(shi)，以(yi)多(duo)聚(ju)體存(cun)在(zai)，可(ke)檢(jian)測(ce)到(dao)紅光(guang)，流(liu)式(shi)檢(jian)測(ce)通(tong)常為 FL-2 通道。細(xi)胞(bao)膜電(dian)位正(zheng) 常時，JC-1 通(tong)過(guo)線粒體膜極性(xing)進(jin)入(ru)線粒體內，並因(yin)濃度升(sheng)高而形成(cheng)發(fa)射(she)紅色熒光(guang) 的(de)多(duo)聚體。而雕亡細(xi)胞(bao)，線粒體跨膜電(dian)位去極化， JC-1 從線粒體內釋放，濃度降(jiang) 低，逆(ni)轉為發射(she)綠(lv)色熒光(guang)的(de)單(dan)體形式(shi)。故(gu)而可(ke)以(yi)通(tong)過(guo)檢(jian)測(ce)綠(lv)色和紅色熒光(guang)檢(jian)測(ce)線粒體膜電(dian)位的(de)變化。