Transwell實驗的步驟(zhou)

    本(ben)文(wen)主要(yao)介紹(shao) 4種(zhong) Transwell實驗的實驗步驟(zhou)，具體(ti)包(bao)括(kuo)：Transwell 腫(zhong)瘤細胞(bao)遷移(yi)實(shi)驗、Transwell 上皮(pi)細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)實驗、Transwell B16 細胞的體(ti)外(wai)遷(qian)移(yi)實(shi)驗、Transwell內皮(pi)細(xi)胞(bao)HMEC-1遷(qian)移(yi)實(shi)驗。
壹、Transwell腫(zhong)瘤細胞(bao)遷移(yi)實(shi)驗
過程(cheng)與Transwell侵襲實驗基(ji)本(ben)壹致(zhi)，不(bu)同(tong)的只(zhi)是不需(xu)要鋪Matrigel。由(you)於(yu)沒(mei)有基(ji)質(zhi)膠的阻(zu)擋，細胞(bao)穿過(guo)膜的速度較(jiao)侵襲實驗明顯(xian)加快(kuai)，所以細胞(bao)量(liang)要更(geng)大(da)。我(wo)做侵襲實驗的細胞密度是(shi)1×10°，而遷(qian)移(yi)實(shi)驗的密度是1×10°。另(ling)外，下(xia)層(ceng)培養(yang)液的FBS濃度也可(ke)適(shi)當下(xia)調，侵襲實驗的濃度是5%，遷移(yi)實(shi)驗的濃度是2.5%。
二、Transwell上皮(pi)細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)
1.將雄性 wistar大(da)鼠(shu)麻醉，開胸(xiong)，將氣(qi)管(guan)取出(chu)，置於(yu)4℃含0.1%胰(yi)蛋(dan)白酶(mei)XIV、100 U/mL青(qing)黴素(su)和(he)100ug/mL鏈黴素(su)、無(wu)Ca²t、無(wu)Mg²t、無(wu)血(xue)清(qing)的MEM。
2.用無(wu)菌(jun)的細胞刮棒刮(gua)氣(qi)管(guan)內壁(bi)，將所得溶液離(li)心後得(de)到(dao)遊(you)離(li)細(xi)胞(bao)。
 
3.離心後立(li)即(ji)用新鮮的上述(shu) MEM溶(rong)液（含10%胎牛(niu)血(xue)清(qing)）清(qing)洗(xi)3次(ci)，以(yi)中和(he)胰(yi)蛋(dan)白酶(mei)，再用(yong)含5%胎牛(niu)血(xue)清(qing)、100 U/mL青黴素(su)和(he)100μg/mL鏈黴素(su)的LHC-8 medium 沖洗(xi)壹次(ci)。
4.沖洗(xi)過(guo)後，將得(de)到(dao)的細胞懸液用(yong)臺盼(pan)蘭測定(ding)活(huo)力(li)，若(ruo)存(cun)活(huo)率(lv)大(da)於(yu) 90%，則將細(xi)胞(bao)以10°/cm2密(mi)度接(jie)種(zhong)於(yu)可(ke)通(tong)透的多聚(ju)碳(tan)濾(lv)膜上（12mm），以(yi)37°C，5%CO2-95%空(kong)氣，含5%胎牛(niu)血(xue)清(qing)，100 U/mL青黴素(su)，100μg/mL鏈黴素(su)的LHC-8medium 孵育6~10天。
5. 孵育後，經(jing)測定(ding)跨(kua)上皮(pi)電阻(zu)在(zai)1000-2000Q之間，即(ji)可(ke)用於(yu)電生(sheng)理試(shi)驗。顯(xian)微(wei)鏡下(xia)氣管(guan)上皮(pi)細(xi)胞(bao)形(xing)細胞(bao)呈(cheng)鋪路(lu)石(shi)狀(zhuang)，圓(yuan)形(xing)核位(wei)於(yu)中央，生(sheng)長(chang)時(shi)常彼(bi)此(ci)緊(jin)密連(lian)接(jie)成單(dan)層(ceng)細胞(bao)片。
三(san)、Transwell B16細(xi)胞的體(ti)外(wai)遷(qian)移(yi)實(shi)驗
把 Transwell 倒(dao)置，在(zai) Transwell 的 PVPF 膜（0.8μm）的下(xia)表面塗壹層(ceng)fibronectin（10 μg/mL，50μL），37 度 2小時(shi)，PBS 洗(xi)壹遍後，放入預(yu)先(xian)每(mei)孔加有600μL的培養基(ji)（含10%血(xue)清(qing)）的24孔板(ban)內，後在(zai)Transwell的內室加入細(xi)胞(bao)（100μL，用含0.1%血(xue)清(qing)的培養基(ji)稀(xi)釋(shi)好(hao)自(zi)己(ji)所需(xu)密度），放入培(pei)養(yang)箱，12-18小時(shi)後，取(qu)出Transwell，用(yong)棉(mian)簽(qian)擦去PVPF膜靠近內室那(na)壹面的細胞，另(ling)壹面的細胞用甲(jia)醛(quan)室(shi)溫固(gu)定(ding)30分(fen)鐘(zhong)，結晶(jing)紫染(ran)色(se)20分鐘(zhong)，用清(qing)水洗(xi)3遍(bian)以(yi)上，後在(zai)顯(xian)微(wei)鏡下(xia)觀察細胞，記(ji)數(shu)。
 
四(si)、內皮(pi)細(xi)胞(bao)HMEC-1遷(qian)移(yi)實(shi)驗
    1%明膠處理(li)的Transwell經(jing)無(wu)血(xue)清(qing)的MCDB131培液於(yu)培養(yang)箱中平(ping)衡(heng)1小時(shi)後上室(shi)加入 100μL 用(yong)serum-free MCDB131稀(xi)釋(shi)的5×104/孔的HMEC及不同(tong)濃度(du)的藥物(wu)，下(xia)室加入0.6mL serum-free的MCDB131培液及20%FCS刺(ci)激(ji)遷移(yi)同(tong)時(shi)設置相(xiang)應陰(yin)性及陽性對(dui)照(zhao)，置於(yu)COa培養(yang)箱中作用8小時(shi)，然後棄(qi)去孔中培液，用(yong)90%酒(jiu)精常(chang)溫固(gu)定(ding)30分(fen)鐘(zhong)，0.1%結晶(jing)紫常(chang)溫染色(se)10分鐘(zhong)，清(qing)水漂(piao)凈，用(yong)棉(mian)簽(qian)輕輕擦掉(diao)上層(ceng)未遷(qian)移(yi)細(xi)胞(bao)，顯(xian)微(wei)鏡下(xia)觀察並(bing)拍(pai)照(zhao)，最後用(yong)10%乙酸(suan)100μL/孔抽提10分(fen)鐘(zhong)，於(yu)600nm處測定(ding)OD值(zhi)。抑(yi)制率計(ji)算公(gong)式(shi)為(wei)：抑制率（%）=【（OD 值(zhi)給(gei)藥組(zu)-OD值(zhi)無(wu)刺(ci)激(ji)陰性對(dui)照(zhao)）/（OD值(zhi)不(bu)加藥陽性對(dui)照(zhao)-OD值(zhi)無(wu)刺(ci)激(ji)陰性對(dui)照(zhao)）×100%。
     蘇州阿(e)爾(er)法(fa)生(sheng)物(wu)提(ti)供(gong)的腫(zhong)瘤細胞(bao)、培養(yang)細(xi)胞(bao)、細(xi)胞培(pei)養基(ji)、胎(tai)牛(niu)血(xue)清(qing)、幹(gan)細胞(bao)等生(sheng)物(wu)試(shi)劑用(yong)於(yu)腫(zhong)瘤研究、新藥開發(fa)等領域。