Vero細胞無(wu)血(xue)清(qing)懸浮(fu)培(pei)養(yang)技術驗證

大多數用(yong)於抗(kang)體(ti)生產(chan)的細(xi)胞主(zhu)要(yao)基(ji)於動(dong)物細(xi)胞上的(de)開發(fa)，如(ru) MRC-5 人二倍(bei)體(ti)細(xi)胞、 Vero 猿(yuan)猴(hou)腎上皮(pi)細(xi)胞、Madin-Darby 犬腎 (MDCK) 細(xi)胞和雞胚成(cheng)纖維細(xi)胞 。尤其是來(lai)自(zi)非(fei)洲綠(lv)猴(hou)腎臟(zang)的 Vero 細(xi)胞已(yi)被廣泛用(yong)於vaccine生產(chan)，因為它們被WHO機(ji)構(gou)證明沒(mei)有(you)致(zhi)癌(ai)潛力。許(xu)多vaccine，例(li)如(ru)針(zhen)對(dui)基(ji)孔肯雅(ya)熱、登(deng)革(ge)熱、日本腦(nao)炎、病(bing)毒(du)性(xing)胃(wei)腸炎、脊(ji)髓(sui)灰質(zhi)炎、狂(kuang)犬病(bing)、羅斯河(he)熱、嚴重(zhong)急性(xing)呼吸系(xi)統(tong)綜(zong)合癥、天(tian)花、西尼羅河(he)腦炎和流感(gan)的 vaccine都是(shi)使用(yong) Vero 細胞培(pei)養(yang)系統開發(fa)的。
用(yong)於virus  vaccine生產(chan)的細(xi)胞依賴於(yu)貼(tie)壁，因此(ci)涉(she)及這(zhe)些細胞的(de)過(guo)程(cheng)不能(neng)輕(qing)易(yi)擴(kuo)大規(gui)模(mo)，因為需要貼壁空(kong)間(jian)和胰蛋白酶(mei)消化(hua)。這(zhe)導致了具(ju)有懸浮(fu)生長能(neng)力(li)的永(yong)生和穩(wen)定(ding)細胞系(xi)的(de)發(fa)展.近(jin)期研究(jiu)中，研究人員成(cheng)功(gong)地在(zai)微載(zai)體(ti)上培(pei)養(yang)了 Vero 細(xi)胞，用(yong)於制(zhi)備(bei)這(zhe)些細胞的(de)懸浮(fu)培(pei)養(yang)物。實驗表明，在(zai)沒(mei)有(you)微載(zai)體(ti)的情況下培(pei)養(yang)的懸浮(fu)適應性(xing) Vero 細(xi)胞比(bi)貼(tie)壁 Vero 細胞產(chan)生更高(gao)量的 virus。
Vero 細(xi)胞培(pei)養(yang)使用(yong)動(dong)物來(lai)源的(de)成(cheng)分較(jiao)多(duo)，如(ru)血(xue)清(qing)、胰蛋白酶(mei)、乳(ru)清(qing)蛋白等(deng)。由(you)於成(cheng)本高(gao)和批(pi)次間(jian)差(cha)異(yi)，盡(jin)量使用(yong)血(xue)清(qing)。此(ci)外(wai)，牛血(xue)清(qing)的(de)病毒(du)、細菌(jun)和真菌(jun)、支(zhi)原(yuan)體汙(wu)染也(ye)是(shi)細(xi)胞培(pei)養(yang)中的主(zhu)要(yao)汙(wu)染來(lai)源。因此(ci)，無(wu)血(xue)清(qing)細(xi)胞培(pei)養(yang)體系的優(you)化(hua)對(dui)於(yu)疫苗(miao)株的生產(chan)是必(bi)要(yao)的。  之(zhi)前的(de)研究中(zhong)，在(zai)無(wu)血(xue)清(qing) EX-Cell MDCK 中(zhong)培(pei)養(yang)的 MDCK 細胞比(bi)在(zai)含(han)血(xue)清(qing)的(de) Glasgow 低(di)必(bi)需培(pei)養(yang)基(ji)中培(pei)養(yang)的細胞產(chan)生更多(duo)的(de) virus。此外(wai)，還探(tan)索了在(zai)無血(xue)清(qing)培(pei)養(yang)基(ji)中培(pei)養(yang) Vero 細胞來(lai)生產(chan)許(xu)多virus  vaccine。
在這(zhe)項研究中(zhong)，我們試(shi)圖促(cu)進(jin) Vero 細(xi)胞在(zai)振(zhen)蕩懸浮(fu)培(pei)養(yang)系統中的(de)適應性(xing)，並(bing)確(que)定(ding)哪(na)種培(pei)養(yang)基(ji)適合在無血(xue)清(qing)的(de)情況下培(pei)養(yang) Vero 細胞。與傳(chuan)統(tong)的 Vero 細(xi)胞貼(tie)壁培(pei)養(yang)相比，Vero 細(xi)胞成(cheng)功(gong)地適應了懸浮(fu)培(pei)養(yang)系統並(bing)產(chan)生了更(geng)多的(de) Adv。
實驗前準(zhun)備(bei)：
Vero 和 FRhk-4 細胞使(shi)用(yong) 10% 胎牛血(xue)清(qing)的(de)DMEM培(pei)養(yang)基(ji)，培(pei)養(yang)基(ji)中添加(jia)1u/mL的(de)青黴素和 1 µg/mL 鏈(lian)黴素。培(pei)養(yang)條(tiao)件為 5% CO₂含量，37℃。
MRC-5 細胞在(zai)含(han)有(you) 10% FBS 和 1 U/mL 青黴素和 1 µg/mL 鏈(lian)黴素的改良(liang)型 Eagle 培(pei)養(yang)基(ji)中。培(pei)養(yang)條(tiao)件為 5% CO 2中， 37℃培(pei)養(yang)。
5 型 Adv (Ad5)  - GFP綠色熒(ying)光蛋白 。使(shi)用(yong)含有(you) 2% FBS 的(de) DMEM 在(zai) Vero 細胞中(zhong)進(jin)行轉染繁殖(zhi)。
壹、培(pei)養(yang)基(ji)的選(xuan)擇(ze)性(xing)實驗
OptiPRO SFM 和 VP-SFM 是無(wu)血(xue)清(qing)、超(chao)低(di)蛋白培(pei)養(yang)基(ji)，不含(han)蛋白質(zhi)、肽或(huo)其他動(dong)物或(huo)人類來(lai)源的(de)成(cheng)分。
Gibco 的(de)Opt-MEM 減(jian)血(xue)清(qing)培(pei)養(yang)基(ji)是壹種改進的(de) MEM，可(ke)以減(jian)少(shao) FBS 的(de)添(tian)加(jia)量。UltraCULTURE 培(pei)養(yang)基(ji)是壹種無血(xue)清(qing)培(pei)養(yang)基(ji)，設計(ji)用(yong)於培(pei)養(yang)補充有重組(zu)人胰島(dao)素、牛(niu)轉鐵蛋白和牛血(xue)清(qing)蛋白（包(bao)括(kuo)白蛋白）的(de)純(chun)化(hua)混合物的哺(bu)乳(ru)動(dong)物細(xi)胞類型。
SFM4MegaVir屬於壹(yi)種無蛋白培(pei)養(yang)基(ji)，使用(yong)這(zhe)種培(pei)養(yang)基(ji)的目的(de)在(zai)於(yu)提(ti)高(gao)不含(han)動(dong)物來(lai)源成(cheng)分的(de)virus  vaccine生 產(chan)過程(cheng)的產(chan)量。實驗過程(cheng)中需(xu)要 逐步降低(di) FBS 的(de)百分比(bi)值(zhi)，來(lai)適應無(wu)血(xue)清(qing)培(pei)養(yang)條(tiao)件。
我們主(zhu)要(yao)在(zai)Optipro、UltraCULTURE、SFM4MegaVir、OptiMEM 和 VP-SFM這(zhe)五(wu)種培(pei)養(yang)基(ji)中嘗試(shi)了細(xi)胞適應。
1.細(xi)胞在(zai) 5% CO2 下培(pei)養(yang)2條(tiao)件37℃。將細胞以1×10 ⁶ 個(ge)細(xi)胞/培(pei)養(yang)皿的濃度(du)接種在細胞培(pei)養(yang)皿中。
2.在 37℃、5% CO 2條(tiao)件下培(pei)養(yang) 72 小(xiao)時後，使用(yong)細胞計(ji)數儀(yi)和 0.4% 臺盼(pan)藍染色(se)測(ce)定(ding)總細胞數(shu)，然(ran)後(hou)用(yong) 1×10 ⁶ 個細(xi)胞/盤(pan)，逐步(bu)減(jian)少(shao)常規(gui)培(pei)養(yang)基(ji)的百分比(bi)。
3.使(shi)用(yong)放(fang)大 100 倍(bei)的(de)倒置(zhi)相差(cha)顯(xian)微鏡(jing)根(gen)據細胞數(shu)量和形狀評(ping)估(gu)在(zai)培(pei)養(yang)基(ji)中培(pei)養(yang)的細胞的(de)形態(tai)。
二(er)、Vero 細(xi)胞懸浮(fu)培(pei)養(yang)
1.Vero 細胞在(zai) 250 mL 錐(zhui)形瓶中(zhong)在 5% CO 2條(tiao)件置(zhi)於(yu)二氧(yang)化(hua)碳振(zhen)蕩培(pei)養(yang)箱中進行培(pei)養(yang)。貼壁細胞置(zhi)於(yu)錐形瓶中(zhong)，CO2搖床中(zhong)，5% CO 2條(tiao)件下，37℃培(pei)養(yang)5天(tian)；
2.使(shi)用(yong)血(xue)細胞計(ji)數器(qi)以及 0.4% 臺盼藍染色(se)評(ping)估(gu)活(huo)細(xi)胞。
3.接下來(lai)，將粘(zhan)附細胞以1.6×10 ⁵ 個(ge)細(xi)胞/m的(de)密(mi)度(du)添加(jia)到(dao)振(zhen)蕩懸浮(fu)培(pei)養(yang)物中。連續培(pei)養(yang)懸浮(fu)培(pei)養(yang)中的活(huo)細(xi)胞，並(bing)通過臺(tai)盼藍染色(se)監(jian)測(ce)其活(huo)力(li)180天(tian)。
三(san)、細(xi)胞轉染
Ad5  Adv包(bao)含在(zai)巨(ju)細(xi)胞病(bing)毒(du)啟動(dong)子(zi)控(kong)制(zhi)下的 GFP 基(ji)因。用(yong)Vero細胞進(jin)行Adv繁殖(zhi)，然後(hou)用(yong)TCID 50滴定(ding)。為了比(bi)較粘(zhan)附培(pei)養(yang)系統和懸浮(fu)培(pei)養(yang)系統之間(jian)的(de)Adv產(chan)量，將兩(liang)種類型的 Vero 細胞接種（以 1.3×10 ⁶ 個(ge)細(xi)胞/mL 的(de)密(mi)度(du)）在培(pei)養(yang)皿或(huo)錐形瓶中(zhong)並(bing)孵(fu)育 5 小(xiao)時。然後以0.1的(de)感(gan)染復數(shu)感(gan)染細(xi)胞5天(tian)。通過使(shi)用(yong)熒(ying)光酶標儀(yi)測(ce)量熒(ying)光強度(du)來(lai)確(que)定(ding)產(chan)生的 Ad5-GFP 的(de)相對量並(bing)使用(yong) GraphPad Prism ver.軟(ruan)件進(jin)行統計(ji)分析(xi)。
四(si)、統計(ji)分析(xi)
數(shu)據表示為平(ping)均(jun)值(zhi)±平(ping)均(jun)值(zhi)的(de)標準誤(wu)差(cha)。使(shi)用(yong) GraphPad Prism ver. 進行統計(ji)分析(xi)。所(suo)有 p 值均(jun)使(shi)用(yong)未配(pei)對(dui)的(de)雙尾(wei)學(xue)生 t 檢(jian)驗(yan) (α=0.05) 在(zai) p<0.001 的(de)顯(xian)著(zhe)性(xing)水(shui)平(ping)上進(jin)行評(ping)估(gu)。
五(wu)、Vero細胞無(wu)血(xue)清(qing)懸浮(fu)培(pei)養(yang)技術驗證
為了研(yan)究Vero細(xi)胞是(shi)否(fou)可(ke)以在(zai)無(wu)血(xue)清(qing)條(tiao)件下培(pei)養(yang)，對Vero細胞的(de)形態(tai)變化(hua)和生長速(su)率(lv)進行了VP-SFM、Ultraculture、OptiPRO-SFM、Opti-MEM和SFM4MegaVir測(ce)試(shi)。在低(di)血(xue)清(qing)培(pei)養(yang)條(tiao)件下，在 OptiPRO、SFM4MegaVir 或(huo) VP-SFM 中培(pei)養(yang)的 Vero 細胞表(biao)現(xian)出(chu)與在(zai)常規(gui)培(pei)養(yang)基(ji)（含 10% FBS 的 DMEM）中(zhong)培(pei)養(yang)的 Vero 細胞相似的(de)形態(tai)（圖 1A ）). 然而，在 Ultraculture 或(huo) Opti-MEM 中培(pei)養(yang)的 Vero 細胞表(biao)現(xian)出(chu)異常形態(tai)，例(li)如(ru)細胞聚(ju)集，這(zhe)在常規(gui)培(pei)養(yang)條(tiao)件下是觀(guan)察(cha)不到(dao)的(de)。當(dang)血(xue)清(qing)濃度(du)從 10% 降(jiang)低(di)到(dao) 0% 時，OptiPRO 培(pei)養(yang)的 Vero 細胞在(zai) 0% FBS 的(de)初始培(pei)養(yang)階段生長速(su)率(lv)降低(di)，但(dan)與常規(gui)培(pei)養(yang)條(tiao)件（DMEM）相比，它(ta)們的生長速(su)率(lv)增(zeng)加(jia)並(bing)更高(gao)在(zai) 0% FBS 中培(pei)養(yang) 51 天(tian)後(hou)，含 10% FBS）（圖 1B）。然而，在 VP-SFM 或(huo) SFM4MegaVir 培(pei)養(yang)基(ji)中培(pei)養(yang)的 Vero 細胞的(de)生長速(su)率(lv)低(di)於(yu)在常規(gui)培(pei)養(yang)條(tiao)件下培(pei)養(yang)的 Vero 細胞。總(zong)的(de)來(lai)說，使(shi)用(yong) OptiPRO 無血(xue)清(qing)培(pei)養(yang)基(ji)培(pei)養(yang) Vero 細胞時不會(hui)發(fa)生形態(tai)變化(hua)和生長速(su)率(lv)下降。


 
圖 1
(A) 在無(wu)血(xue)清(qing)條(tiao)件下生長的(de) Vero 細(xi)胞形態(tai)。藍色和紅色(se)箭(jian)頭代表(biao)異常的細(xi)胞生長。(B) 與在(zai)含(han)有 10% FBS 的(de) DMEM 中培(pei)養(yang)的細胞（對(dui)照(zhao)；藍線）相比，在(zai)無(wu)血(xue)清(qing)條(tiao)件下培(pei)養(yang)的細胞的(de)生長速(su)率(lv)。DMEM，Dulbecco 改良的(de) Eagles 培(pei)養(yang)基(ji)；FBS，胎牛血(xue)清(qing)。




對(dui)照(zhao)組(zu)實驗

我們測(ce)試(shi)了 Vero 細(xi)胞的(de)無(wu)血(xue)清(qing)條(tiao)件是否可(ke)以應(ying)用(yong)於另(ling)壹(yi)種疫苗(miao)株生產(chan)細胞系(xi) MRC-5 和對照(zhao)細(xi)胞，即(ji) FRhk-4 細(xi)胞。與在(zai)常規(gui)培(pei)養(yang)基(ji)（含有 10% FBS 的(de) MEM）中(zhong)培(pei)養(yang)的細胞相比，在(zai) SFM4MegaVir Opti-Pro 或(huo) VP-SFM 中培(pei)養(yang)的所有 MRC-5 細(xi)胞均(jun)顯(xian)示出(chu)異(yi)常的細(xi)胞形態(tai)，例(li)如(ru)細胞縮(suo)短(duan)（圖 2A ）。在 Opti-MEM、SFM4MegaVir、Opti-Pro、VP-SFM 或(huo) Ultraculture 中培(pei)養(yang)的 FRhk-4 細胞未(wei)顯(xian)示任(ren)何(he)異(yi)常形態(tai)（圖 2C）). MRC-5 細胞在(zai) VP-SFM 或(huo) OptiPRO 無血(xue)清(qing)培(pei)養(yang)基(ji)中的生長速(su)率(lv)低(di)於(yu)在常規(gui)培(pei)養(yang)基(ji)（含 10% FBS 的 MEM）中(zhong)培(pei)養(yang)的細胞，但(dan)在(zai) Opti-MEM 或(huo) Ultraculture 培(pei)養(yang)基(ji)中則不然(ran)。然(ran)而，由於(yu)細胞形態(tai)的(de)變化(hua)，在(zai) Opti-MEM 或(huo) Ultraculture 中培(pei)養(yang)的 MRC-5 細胞在(zai) 8% FBS 下無法持續減少(shao)（圖 2B）。在 VP-SFM 或(huo) Opti-MEM 中培(pei)養(yang)的 FRhk-4 細胞顯(xian)示出(chu)與在(zai)常規(gui)培(pei)養(yang)基(ji)中培(pei)養(yang)期間相似的(de)生長速(su)率(lv)（圖 2D）。


總之(zhi)，在沒(mei)有(you) FBS 的(de)情(qing)況下，Vero 細胞的(de)適宜培(pei)養(yang)條(tiao)件可(ke)能不適用(yong)於其他疫苗(miao)株生產(chan)細胞，例(li)如(ru) MRC-5 細胞。
    蘇(su)州(zhou)阿(e)爾(er)法生物實驗器(qi)材(cai)有限(xian)公司提(ti)供(gong)的(de)幹(gan)細胞專(zhuan)培(pei)養(yang)基(ji)、無血(xue)清(qing)培(pei)養(yang)基(ji)、DMEM培(pei)養(yang)基(ji)、三(san)系(xi)分化(hua)誘(you)導分化(hua)培(pei)養(yang)基(ji)、幹(gan)細胞培(pei)養(yang)基(ji)、預篩(shai)選(xuan)胎牛血(xue)清(qing)等(deng)細(xi)胞培(pei)養(yang)試(shi)劑，另(ling)提(ti)供(gong)細(xi)胞培(pei)養(yang)瓶、nest錐(zhui)形瓶、細(xi)胞培(pei)養(yang)皿等(deng)細(xi)胞培(pei)養(yang)耗材(cai)，更多(duo)實驗室儀(yi)器(qi)設備(bei)、試(shi)劑耗(hao)材(cai)采(cai)購(gou)可(ke)以進(jin)入(ru)進(jin)行了解。