壹(yi)文(wen)了解(jie)細(xi)菌內毒(du)素

內毒(du)素(Endotoxin)是壹(yi)種脂(zhi)多糖(LPS)，來(lai)源於(yu)革蘭(lan)氏陰(yin)性細(xi)菌外膜(mo)，其細(xi)胞(bao)壁外膜(mo)的外部(bu)脂(zhi)質(zhi)成分(fen)由(you)內(nei)毒(du)素分(fen)子(zi)組成，細(xi)胞(bao)死(si)亡(wang)或(huo)分(fen)解(jie)後(hou)被釋(shi)放(fang)出來(lai)。LPS具有(you)三個結構，由(you)菌體特(te)異性多糖、非特(te)異性核(he)心多糖和(he)脂(zhi)質(zhi)A三部(bu)分(fen)構成(cheng)。內(nei)毒(du)素單體分(fen)子(zi)量(liang)為10kDa左右(you)，在不(bu)同成(cheng)分(fen)水(shui)溶液中，可(ke)形成大分(fen)子(zi)聚(ju)集體，大(da)的可(ke)超過1000 kDa。類(lei)脂(zhi)A是內毒(du)素多種生(sheng)物(wu)活性或(huo)毒(du)性反(fan)應(ying)的主要基(ji)團(tuan)。該基(ji)團(tuan)沒有(you)種屬(shu)特(te)異性, 所以(yi)各(ge)屬(shu)細(xi)菌的類脂(zhi)A 結構相似, 其毒(du)性反(fan)應(ying)相似，如發熱、血液流動(dong)力學(xue)改(gai)變(bian)、彌漫性血(xue)管(guan)內凝(ning)血, 並(bing)導(dao)致休(xiu)克(ke)等。O-特異多糖位於(yu)菌體胞(bao)壁(bi)的最(zui)外層(ceng)，由(you)若(ruo)幹重(zhong)復(fu)的寡糖單位(wei)組成。多糖的種類(lei)與(yu)含(han)量(liang)決(jue)定著細(xi)菌種、型(xing)的特異性，以(yi)及(ji)不同細(xi)菌間具(ju)有的共同抗(kang)原(yuan)性。它(ta)還(hai)參(can)與(yu)細(xi)菌的抗補體溶(rong)解(jie)作(zuo)用。

內毒(du)素不是蛋白質(zhi), 熱穩定(ding)性強(qiang)。在(zai) 100℃的高溫下(xia)加(jia)熱(re)1h 也不會(hui)被破(po)壞(huai), 115℃30m in 濕(shi)熱(re)僅(jin)能(neng)破(po)壞(huai) 25% 左(zuo)右(you)的熱原(yuan)質(zhi)。只有 180℃ 3～ 4h 或(huo) 250℃ 1～ 2h 幹烤(kao), 或(huo)用強堿(jian)、強酸(suan)或(huo)強氧(yang)化劑加(jia)溫煮(zhu)沸 30min才(cai)能(neng)破(po)壞(huai)它(ta)的生物活性。

內(nei)毒(du)素帶有負電荷, 由(you)於(yu)脂(zhi)多糖結構中類(lei)脂(zhi) A 的疏水(shui)性, 使(shi)得(de)內毒(du)素傾向於(yu)以(yi)高分(fen)子(zi)聚(ju)合物(wu)的狀態存在而(er)難溶於(yu)水, 並(bing)由(you)於(yu)環境(jing)中 Ca2+、Mg2+等(deng)被吸(xi)引(yin)到帶負電荷的脂(zhi)多糖上(shang)而(er)得(de)以(yi)穩定。通(tong)常其(qi)分(fen)子(zi)量(liang)幾(ji)十(shi)萬(wan)至(zhi)上(shang)千萬(wan)道爾頓。

內(nei)毒(du)素的產生：

基(ji)因(yin)工程(cheng)蛋白(bai)通(tong)常采用細(xi)菌、酵母(mu)、哺乳動(dong)物細(xi)胞(bao)或(huo)昆蟲(chong)細(xi)胞(bao)作(zuo)為(wei)宿(xiu)主進(jin)行(xing)大(da)規模發酵生產, 但(dan)大多是以(yi)大腸菌作(zuo)為(wei)表(biao)達(da)系統(tong)。以(yi)大腸桿菌作(zuo)為(wei)表(biao)達(da)系統(tong)的蛋白通(tong)常都(dou)是在胞內表達(da), 在純(chun)化蛋白(bai)之前(qian)必(bi)須(xu)通(tong)過高(gao)壓(ya)勻(yun)漿、超聲(sheng)波破(po)碎或(huo)低(di)壓(ya)滲透(tou)等方法(fa)將菌種破(po)壁(bi), 以(yi)釋放蛋白(bai)。同時(shi)細(xi)胞(bao)壁內的脂(zhi)多糖也大(da)量(liang)釋放到(dao)緩沖液中, 通(tong)常 10% 的濕菌濃度可(ke)產生幾(ji)萬(wan)EU/mL 的內毒(du)素, 這(zhe)是內毒(du)素的主要來(lai)源。

對於(yu)酵母(mu)表達(da)系統(tong)或(huo) CHO (中國倉(cang)鼠(shu)卵巢(chao)細(xi)胞(bao)系) 系統(tong)等, 雖(sui)然表達(da)系統(tong)本身不產(chan)生(sheng)內毒(du)素, 但(dan)在生(sheng)產(chan)過程(cheng)中因(yin)原(yuan)輔(fu)材料(liao), 生產(chan)環境(jing)以(yi)及(ji)個人操作(zuo)等(deng)因(yin)素造成(cheng)產(chan)品內毒(du)素汙染, 這(zhe)是產生內毒(du)素的另壹(yi)來(lai)源。

在生產過程(cheng)中如何防止(zhi)內(nei)毒(du)素汙染：

①粗(cu)純(chun)中防止(zhi)內(nei)毒(du)素汙染 無(wu)論是酵母菌、哺乳動(dong)物細(xi)胞(bao)、昆蟲(chong)細(xi)胞(bao)表達(da)系統(tong)還(hai)是大腸桿菌表達(da)系統(tong), 在生(sheng)產過程(cheng)中以(yi)各(ge)種途徑(jing)利(li)用各(ge)種方法(fa)有(you)效地防止(zhi)內(nei)毒(du)素汙染均(jun)是非常(chang)重(zhong)要的。前者本身不產(chan)生(sheng)內毒(du)素, 只要(yao)在(zai)生產過程(cheng)中能(neng)有效(xiao)防止(zhi)內(nei)毒(du)素的汙染, 就(jiu)可(ke)以(yi)得(de)到熱原(yuan)合格(ge)的產品; 後者雖(sui)然不可(ke)避免(mian)地產(chan)生(sheng)內(nei)毒(du)素, 但(dan)通(tong)常在(zai)初步純(chun)化中已(yi)采取(qu)有(you)效措(cuo)施, 可(ke)以(yi)大量(liang)減少(shao)內毒(du)素含量(liang)。

②通(tong)過無(wu)菌操作(zuo)和(he)控(kong)制操(cao)作(zuo)區(qu)潔(jie)凈(jing)度來(lai)防止(zhi)外(wai)源性內(nei)毒(du)素汙染。首先(xian), 生(sheng)產車間(jian)必須(xu)是符(fu)合 GMP要(yao)求的潔凈(jing)廠(chang)房, 各(ge)種不(bu)同的操作(zuo)在(zai)不(bu)同的潔凈(jing)區(qu)內進(jin)行(xing), 例如發酵和(he)粗(cu)純(chun)應該在十萬(wan)級區進(jin)行(xing), 精純(chun)在萬(wan)級區域內進(jin)行(xing), 制(zhi)劑(ji)、分(fen)裝(zhuang)須(xu)在百(bai)級間或(huo)層流罩(zhao)下進(jin)行(xing)操(cao)作(zuo)。對(dui)於(yu)任何(he)非封(feng)閉(bi)系統(tong)的操作(zuo), 均(jun)應(ying)采取(qu)無(wu)菌操作(zuo)方式(shi), 如果(guo)系(xi)統(tong)自動(dong)化程(cheng)度較(jiao)高, 可(ke)遙控(kong)操作(zuo)或(huo)較(jiao)少(shao)手工(gong)操(cao)作(zuo)。

③對(dui)於(yu)任何(he)直接接觸制品的溶液、容(rong)器(qi)、生(sheng)產(chan)用具、管(guan)路、生(sheng)產系統(tong)等必(bi)須(xu)進(jin)行(xing)嚴(yan)格(ge)有(you)效(xiao)的處(chu)理, 去除(chu)熱原(yuan)。用蒸餾法(fa)或(huo)反滲(shen)法(fa)制備的新鮮(xian)註射用水或(huo)滅(mie)菌註射用水通(tong)常都(dou)是無熱原(yuan)的, 這(zhe)是清洗器(qi)具及(ji)配(pei)制(zhi)溶液的基(ji)礎(chu)。生產器具(ju)壹(yi)類(lei)是玻璃器皿, 不(bu)銹(xiu)鋼(gang)制品, 這(zhe)些器具可(ke)置180℃ 3～ 4h 或(huo) 250℃ 1～ 2h幹烤(kao), 除(chu)去熱(re)原(yuan)。另壹(yi)類(lei)為橡(xiang)膠、塑(su)料(liao)制品(pin), 如膠塞(sai)、膠管(guan)等, 可(ke)采用 0.1M鹽酸(suan)煮(zhu)沸30min, 或(huo) 0.1M氫(qing)氧化鈉浸(jin)泡 4h以(yi)上(shang), 急用時可(ke)煮(zhu)沸30min, 然(ran)後(hou)用新鮮(xian)註射用水沖(chong)洗凈(jing), 再高(gao)壓(ya)滅(mie)菌。對於(yu)生物(wu)制藥(yao)的某(mou)些關鍵步驟可(ke)采用無菌、無熱(re)原(yuan)的壹(yi)次(ci)性器(qi)具(ju), 既可(ke)以(yi)減輕勞(lao)動(dong)量(liang), 又可(ke)以(yi)防止(zhi)清洗不(bu)凈(jing)帶來(lai)的汙染。溶(rong)液配(pei)制(zhi)要使用無熱(re)原(yuan)的新鮮(xian)註射用水, 整(zheng)個過程(cheng)必須(xu)於(yu) 3h 內完(wan)成, 並(bing)及(ji)時高(gao)壓(ya)滅(mie)菌。對於(yu)壹(yi)些不能(neng)滅(mie)菌的溶液, 可(ke)通(tong)過超(chao)濾(lv)法除(chu)熱原(yuan)。如(PBS) 在高(gao)壓(ya)滅(mie)菌時會(hui)產(chan)生(sheng)具(ju)有紫外吸(xi)收(shou)的焦(jiao)磷酸(suan), 在(zai)使用磷酸(suan)鹽(yan)液緩(huan)液(PBS) 進(jin)行(xing)柱(zhu)層(ceng)析時, 就(jiu)對(dui)層析圖譜(pu)產(chan)生(sheng)幹擾, 在幹擾素的生產與檢定中曾(zeng)經(jing)出(chu)現(xian)過這(zhe)樣的問題(ti), 采用截留相對分(fen)子(zi)質(zhi)量(liang) (NMWL ) 為 10kDa的超濾(lv)膜超濾(lv)可(ke)有效去除(chu)溶液中的熱原(yuan)。

生物技(ji)術(shu)藥(yao)品(pin)的生產中, 對(dui)於(yu)系統(tong)、管(guan)路的清洗涉(she)及(ji)在位(wei)清洗(CIP)/在(zai)位滅(mie)菌(SIP)的概(gai)念主要是針(zhen)對(dui)泵、管(guan)道、閥門(men)、濾(lv)器、柱、各(ge)種罐等(deng)需(xu)定(ding)期(qi)清洗滅(mie)菌的設備,常(chang)規要求在不(bu)拆任(ren)何(he)組件(jian)的情況(kuang)下原(yuan)位進(jin)行(xing)。例如層析系統(tong),它(ta)是生物技(ji)術(shu)藥(yao)品(pin)生(sheng)產中廣(guang)泛(fan)使(shi)用的單元(yuan)操(cao)作(zuo),在(zai)清洗/在(zai)位滅(mie)菌十分(fen)重(zhong)要,有(you)效(xiao)的在位清可(ke)以(yi)減少(shao)產品(pin)汙(wu)染的危(wei)險(xian)性、維(wei)持柱(zhu)效(xiao)和(he)提(ti)高介質(zhi)壽命。氫(qing)氧化鈉被經(jing)常(chang)用作(zuo)在(zai)位(wei)清洗時(shi)的清洗液。

細(xi)菌內毒(du)素的檢測：

細(xi)菌內毒(du)素檢查(zha)法(fa)系(xi)利(li)用鱟試(shi)劑來(lai)檢測或(huo)量(liang)化由(you)革(ge)蘭(lan)陰(yin)性菌產生(sheng)的細(xi)菌內毒(du)素, 以(yi)判(pan)斷供(gong)試(shi)品中細(xi)菌內毒(du)素的含量(liang)是否(fou)符(fu)合規定的壹(yi)種方法(fa)。鱟(hou)試劑法的反應機理是細(xi)菌內毒(du)素在二(er)價(jia)陽(yang)離子(zi)參(can)與(yu)下(xia)激(ji)活鱟(hou)血細(xi)胞(bao)溶解(jie)物(wu)中的壹(yi)系(xi)列凝(ning)聚(ju)酶(mei)的反應。其包括(kuo)兩種方法(fa)，即(ji)凝(ning)膠法(fa)和(he)光(guang)度測定(ding)法，後(hou)者包括濁(zhuo)度法和(he)顯(xian)色基(ji)質(zhi) 法。檢測時(shi)可(ke)用其中任(ren)壹(yi)種方法(fa)，當(dang)結果(guo)有(you)爭(zheng)議時(shi)，另(ling)有規定外(wai)，以(yi)凝(ning)膠法(fa)結果(guo)為(wei)準。鱟試劑法(fa)具(ju)有(you)簡(jian)便(bian)、迅速、定(ding)量(liang)準確、靈敏(min)度高等(deng)優點，在(zai)國際(ji)上(shang)受(shou)到廣(guang)泛(fan)應(ying)用，已被美(mei)國、歐洲、日本等(deng)國《藥典(dian)》及(ji)《生 物(wu)制品規程(cheng)》收(shou)載，我國2005年版(ban)藥(yao)典也已(yi)收(shou)載，應用於(yu)藥品(pin)、生物(wu)制品的熱原(yuan)檢定。

細(xi)菌內毒(du)素的去除(chu)：

由(you)於(yu)內毒(du)素顯著(zhu)的危(wei)害性，FDA等(deng)法(fa)規也對(dui)內毒(du)素的控(kong)制和(he)將其降(jiang)低(di)到安(an)全(quan)水(shui)平提(ti)出明確要求。無菌操作(zuo)和(he)操(cao)作(zuo)區(qu)潔(jie)凈(jing)度也是控(kong)制外(wai)源性內(nei)毒(du)素汙染的有效手段。然(ran)而(er)對於(yu)樣品(pin)本身就存(cun)在(zai)的內源性內(nei)毒(du)素汙染，即(ji)使外(wai)源性內(nei)毒(du)素得(de)到有效(xiao)控(kong)制，最(zui)終(zhong)工藝制(zhi)備的樣品(pin)也(ye)存在(zai)內(nei)毒(du)素超標的風險(xian)。那麽就需(xu)要(yao)從(cong)樣品(pin)本身制備工(gong)藝(yi)角(jiao)度，結合內(nei)毒(du)素特點，尋(xun)找(zhao)有(you)效(xiao)方法(fa)，使(shi)樣品(pin)本身內毒(du)素(Endotoxin)降低(di)，達(da)到工藝(yi)要求，提(ti)高產(chan)品安全(quan)性。
①疏水(shui)層(ceng)洗(xi)法(fa)：壹(yi)般來(lai)說內毒(du)素的疏水(shui)性都(dou)是遠遠大於(yu)目標物(wu)的，因此(ci)在(zai)疏水(shui)層(ceng)析上(shang)樣需(xu)要(yao)高(gao)鹽(yan)緩(huan)沖液平衡，內(nei)毒(du)素在高(gao)鹽(yan)下發生凝(ning)集，不(bu)結(jie)合疏水(shui)介質(zhi)，因而(er)上(shang)樣時(shi)直接穿透(tou)而(er)被去除(chu)。或(huo)者采取(qu)目(mu)標樣品(pin)流穿模(mo)式(shi)，在壹(yi)定(ding)鹽濃度下使(shi)目的蛋白不結合填(tian)料(liao)，而(er)內毒(du)素分(fen)子(zi)可(ke)與填(tian)料(liao)結合，使(shi)兩者實現(xian)分(fen)離。

②離子(zi)交換法(fa)：對於(yu)陰離子(zi)交換層(ceng)析，內毒(du)素在 pH>2時(shi)帶負電荷，與陰(yin)離子(zi)交換介質(zhi)Q或(huo)DEAE有較(jiao)強結(jie)合, 可(ke)使用目標蛋(dan)白從(cong)陰離子(zi)交換填(tian)料(liao)流穿的方式(shi)去除(chu)內毒(du)素；也可(ke)在目標蛋(dan)白和(he)內(nei)毒(du)素同時(shi)結合於(yu)層析介質(zhi)上(shang)後，由(you)於(yu)內毒(du)素的結合能(neng)力較(jiao)蛋白(bai)的結合能(neng)力強(qiang)，因(yin)此(ci)可(ke)先將目標蛋(dan)白洗(xi)脫(tuo)出來(lai)，然後(hou)再用高鹽(yan)緩沖(chong)液或(huo)NaOH將內毒(du)素洗出(chu)。對(dui)於(yu)陽(yang)離子(zi)交換層(ceng)析，在pH4.0時(shi)，內(nei)毒(du)素還(hai)是帶有負電荷不能(neng)和(he)填(tian)料(liao)結合而(er)隨流動(dong)相流出(chu)層析柱，目(mu)標蛋(dan)白則(ze)可(ke)以(yi)與陽(yang)離子(zi)交換介質(zhi)結合，因(yin)此(ci)采用陽(yang)離子(zi)交換層(ceng)析也可(ke)以(yi)很(hen)好的去除(chu)內毒(du)素。此(ci)外(wai)，采用壹(yi)些表面活性劑(ji)比(bi)如Triton X-114，既能(neng)阻(zu)止(zhi)內(nei)毒(du)素結合在(zai)陰離子(zi)柱(zhu)上(shang)也可(ke)阻(zu)止(zhi)內(nei)毒(du)素結合在(zai)陽(yang)離子(zi)柱(zhu)上(shang)。

③凝(ning)膠過濾(lv)層析：內毒(du)素可(ke)在水溶液中以(yi)非極(ji)性和(he)離子(zi)相互作(zuo)用，形成(cheng)大小為(wei) 1,000 kDa 分(fen)子(zi)聚(ju)集體，它(ta)與(yu)多數(shu)生物蛋(dan)白(bai)分(fen)子(zi)量(liang)差異較(jiao)大，基(ji)於(yu)這(zhe)壹(yi)特(te)征，可(ke)以(yi)采用凝(ning)膠過濾(lv)層析，將大分(fen)子(zi)內(nei)毒(du)素分(fen)子(zi)與(yu)目標蛋(dan)白分(fen)離。但(dan)其處(chu)理量(liang)小, 處(chu)理時間(jian)較(jiao)長(chang)。

④TFF切(qie)向(xiang)流技(ji)術(shu)去除(chu)內毒(du)素：內毒(du)素在不(bu)同的水溶液中，常(chang)形(xing)成聚(ju)集體結(jie)構，因(yin)其(qi)聚(ju)集的程(cheng)度不同，分(fen)子(zi)大(da)小不(bu)壹(yi)。小聚(ju)集體分(fen)子(zi)量(liang)為10~20 kDa，而(er)大聚(ju)集體的分(fen)子(zi)量(liang)可(ke)達(da)1000 kDa。使用切(qie)向(xiang)流膜(mo)孔徑小於(yu)內毒(du)素的分(fen)子(zi)量(liang)而(er)使內毒(du)素分(fen)子(zi)截留，目標樣品(pin)透(tou)過膜(mo)孔(kong)，達(da)到去除(chu)樣品(pin)中內(nei)毒(du)素的目的。影響蛋白(bai)溶(rong)液中內(nei)毒(du)素去除(chu)因素主要包(bao)括(kuo)，目標分(fen)子(zi)的大小分(fen)布(bu)、內毒(du)素與目(mu)標分(fen)子(zi)的相互作(zuo)用、目標蛋(dan)白質(zhi)濃度以(yi)及(ji)是否(fou)添加相應的洗滌劑。

⑤通(tong)過親合層(ceng)析去除(chu)內毒(du)素:  親合層(ceng)析技(ji)術(shu), 特(te)別(bie)是免疫吸(xi)附(fu)劑在(zai)生產中的運用使得(de)生物大(da)分(fen)子(zi)的純(chun)化變得(de)簡(jian)單(dan)。免(mian)疫(yi)吸(xi)附(fu)的原(yuan)理基(ji)於(yu)抗原(yuan)、抗體的特異性作(zuo)用, 以(yi)目標蛋(dan)白作(zuo)為(wei)抗(kang)原(yuan), 將通(tong)過雜(za)交瘤技(ji)術(shu)生(sheng)產(chan)的單克(ke)隆抗體偶聯(lian)於(yu)介質(zhi)上(shang), 以(yi)此(ci)介質(zhi)來(lai)吸(xi)附(fu)目標蛋(dan)白。由(you)於(yu)相互作(zuo)用的高度特異性, 理論上(shang)僅(jin)有(you)目(mu)標蛋(dan)白吸(xi)附(fu)於(yu)介質(zhi)上(shang), 內毒(du)素全(quan)部(bu)穿透(tou), 洗脫(tuo)後將得(de)到純(chun)度很(hen)高的無熱原(yuan)產品。實際(ji)上(shang), 由(you)於(yu)介質(zhi)本身存在(zai)的非特(te)異性吸(xi)附(fu), 仍(reng)有(you)少(shao)量(liang)的雜(za)蛋白(bai)和(he)內(nei)毒(du)素同時(shi)被吸(xi)附(fu), 但(dan)內毒(du)素含量(liang)是極(ji)低(di)的。在幹擾素(IFN)生產(chan)中, 洗(xi)脫(tuo)物內毒(du)素含量(liang)壹(yi)般為(wei)0.25EU/mL。

⑥利(li)用特異性吸(xi)附(fu)內毒(du)素介質(zhi)去除(chu)內毒(du)素：將內毒(du)素底物(wu)LAL或(huo)多粘菌素B(PMB)偶聯(lian)於(yu)層析介質(zhi)上(shang), 以(yi)此(ci)介質(zhi)特異性吸(xi)附(fu)內毒(du)素, 而(er)蛋白不(bu)會(hui)被該層析介質(zhi)吸(xi)附(fu)隨流動(dong)相流出(chu)，收(shou)集該流出(chu)蛋白即可(ke)。該方法(fa)去除(chu)內毒(du)素效果(guo)較(jiao)好, 但(dan)有壹(yi)定(ding)的蛋白損失(shi)。

總的來(lai)說，目前(qian)還(hai)沒有(you)適用於(yu)生物(wu)制藥(yao)工藝中去除(chu)內毒(du)素的通(tong)用方案(an)。尤(you)其內(nei)毒(du)素含量(liang)特別高(gao)的樣品(pin)，單(dan)壹(yi)方式(shi)去除(chu)效果(guo)不(bu)好(hao)時(shi)，需(xu)要(yao)結(jie)合不(bu)同生(sheng)物制(zhi)品(pin)和(he)不(bu)同工(gong)藝的特點，考(kao)慮(lv)多種方式(shi)組合以(yi)降低(di)工藝(yi)過程(cheng)的內毒(du)素雜(za)質(zhi)，提(ti)高產(chan)品安全(quan)性，從(cong)而(er)滿(man)足(zu)相關法規要求。

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