凝(ning)膠電泳(yong)的(de)染(ran)色(se)方法

   凝膠電泳(yong)是研(yan)究蛋(dan)白質(zhi)性質(zhi)的壹(yi)種(zhong)相對(dui)簡(jian)單、快速和高靈(ling)敏度的(de)工具。它是分(fen)析化(hua)學(xue)、生物(wu)化(hua)學(xue)和(he)分(fen)子(zi)生物(wu)學(xue)的(de)主要工具。通(tong)過電(dian)泳分(fen)離蛋(dan)白質(zhi)是基(ji)於(yu)這樣(yang)壹(yi)個(ge)事(shi)實(shi)，即(ji)帶(dai)電分子(zi)將(jiang)在(zai)施加(jia)電場(chang)時通(tong)過基(ji)質(zhi)遷移(yi)。蛋(dan)白質(zhi)電泳(yong)分(fen)離(li)的(de)基(ji)質(zhi)是聚丙烯酰胺。用(yong)於(yu)形成(cheng)聚丙烯酰胺的(de)化(hua)學(xue)試(shi)劑(ji)是單體丙烯(xi)酰胺和(he)N，N'-雙丙烯(xi)酰胺（雙-丙烯(xi)酰胺）。聚合(he)丙烯(xi)酰胺和(he)雙丙烯(xi)酰的方法是使(shi)用TEMED（四(si)*基(ji)乙(yi)二胺）和(he)過(guo)硫(liu)酸銨。聚丙烯酰胺凝(ning)膠內部的聚合(he)形成(cheng)了壹個(ge)交(jiao)聯(lian)的微孔網絡。這種(zhong)孔隙(xi)網絡允(yun)許(xu)小(xiao)蛋(dan)白質(zhi)分子(zi)快速通(tong)過，同時減緩較大蛋(dan)白質(zhi)的遷(qian)移(yi)，這導(dao)致蛋(dan)白質(zhi)基(ji)於(yu)其(qi)分(fen)子(zi)大(da)小(xiao)實(shi)現(xian)分(fen)離。凝(ning)膠電泳(yong)是壹(yi)種(zhong)檢測(ce)蛋(dan)白質(zhi)純度、評(ping)估(gu)蛋(dan)白質(zhi)分子(zi)量(liang)的強有力的生化分(fen)析方法。在(zai)電泳(yong)系(xi)統中,蛋(dan)白條帶染(ran)色(se)是壹(yi)個(ge)重(zhong)要的(de)步驟(zhou)，因為(wei)它直接(jie)關系(xi)到(dao)試(shi)驗(yan)結(jie)果(guo)能(neng)否(fou)使(shi)用。目(mu)前(qian)，常(chang)用(yong)的蛋(dan)白質(zhi)染(ran)色(se)方法主要有(you)考(kao)馬斯(si)亮(liang)藍染(ran)色(se)法、銀染(ran)法(fa)、負染(ran)法(fa)和熒(ying)光(guang)染(ran)色(se)法。
考馬斯(si)亮(liang)藍染(ran)色(se)法
發展(zhan)歷(li)史：1963 年(nian) Fazekas 等將(jiang)考(kao)馬斯(si)亮(liang)藍R-250應(ying)用到(dao)醋(cu)酸纖維(wei)素膜上的(de)蛋(dan)白質(zhi)染(ran)色(se)。1965年Meyer等人將(jiang)該方法用(yong)於(yu)聚丙烯酰胺凝(ning)膠電泳(yong)中蛋(dan)白的染(ran)色(se)，其(qi)檢(jian)測(ce)靈(ling)敏度約為(wei)200~500ng。隨後考(kao)馬斯(si)亮(liang)藍染(ran)色(se)法逐(zhu)漸被推廣使(shi)用，現(xian)已(yi)成(cheng)為(wei)各實(shi)驗(yan)室(shi)重(zhong)要的(de)檢(jian)測(ce)方法。染(ran)色(se)原理：考馬斯(si)亮(liang)藍是二(er)磺(huang)酸化的三苯甲烷(wan)類(lei)染(ran)料，在酸性條件(jian)下，該染(ran)料可通(tong)過磺(huang)酸基(ji)和(he)蛋(dan)白質(zhi)分子(zi)上(shang)質(zhi)子(zi)化(hua)的(de)堿(jian)性(xing)氨基(ji)酸間通(tong)過靜(jing)電相互(hu)作(zuo)用(yong)相結(jie)合(he)。其(qi)次(ci)，該染(ran)料還(hai)可以通(tong)過其(qi)疏(shu)水性基(ji)團(tuan)(苯環)和(he)蛋(dan)白質(zhi)的疏(shu)水性區(qu)域產生疏(shu)水作用力，同時該染(ran)料和蛋(dan)白還(hai)存(cun)在氧(yang)鍵(jian)和(he)範(fan)德(de)華(hua)力的作(zuo)用(yong)。
目前廣泛用(yong)的考馬斯(si)亮(liang)藍有(you)G-250和(he)R-250兩(liang)種(zhong)，R-250比G-250少(shao)2個甲基(ji)。遊(you)離(li)狀態(tai)的考馬斯(si)亮(liang)藍G250在(zai)酸性溶(rong)液(ye)中呈藍偏綠色(se)，與(yu)蛋(dan)白質(zhi)結(jie)合(he)後呈藍色(se)，考(kao)馬斯(si)亮(liang)藍G-250由(you)於(yu)與(yu)蛋(dan)白質(zhi)的結(jie)合(he)反應(ying)十分(fen)迅(xun)速，常(chang)用(yong)於(yu)蛋(dan)白質(zhi)含量(liang)的測(ce)定，也(ye)可染(ran)膠，但(dan)脫(tuo)色較(jiao)慢較(jiao)難(nan)。考(kao)馬斯(si)亮(liang)藍R-250呈藍色(se)，有(you)輕微紅(hong)色(se)，與(yu)蛋(dan)白質(zhi)反應(ying)雖然(ran)比較緩(huan)慢，但(dan)是可以被洗(xi)脫(tuo)下去，所(suo)以常(chang)用(yong)來(lai)對(dui)電(dian)泳條帶染(ran)色(se)。
 
考馬斯(si)亮(liang)藍染(ran)色(se)法的優點(dian)：由(you)於(yu)考馬斯(si)亮(liang)藍具(ju)有(you)成(cheng)本(ben)低、操(cao)作便捷(jie)及質(zhi)譜兼(jian)容性好等特(te)點，使(shi)得該類(lei)染(ran)料成為(wei)常(chang)用(yong)的蛋(dan)白質(zhi)染(ran)色(se)染(ran)料。考馬斯(si)亮(liang)藍染(ran)色(se)法的缺(que)點：染(ran)色(se)靈(ling)敏度低(di)，約為(wei)幾十(shi)納(na)克(ke)到(dao)幾(ji)微(wei)克，對低豐度(du)蛋(dan)白質(zhi)的顯(xian)色(se)較(jiao)差；染(ran)色(se)時間長(chang)，並(bing)且凝膠有比較深(shen)的(de)背景(jing)，需(xu)要較(jiao)長(chang)時間的脫(tuo)色，實(shi)驗(yan)時間較長(chang)；由(you)於(yu)染(ran)色(se)和脫(tuo)色過(guo)程(cheng)中會使(shi)用到(dao)甲醇(chun)和冰(bing)乙(yi)酸等有(you)毒或有刺(ci)激性(xing)氣味試劑，對身(shen)體健(jian)康(kang)有(you)害。
銀染(ran)法(fa)
發展(zhan)歷(li)史：1979年(nian)，Switzer等發明(ming)了更(geng)靈(ling)敏的銀染(ran)色(se)方法，該方法比考馬斯(si)亮(liang)藍染(ran)色(se)靈(ling)敏高出(chu)2個(ge)數量(liang)級，它可以檢(jian)測(ce)小(xiao)至(zhi)0.38ng/mm2的牛血清(qing)白蛋(dan)白。
銀染(ran)法(fa)的原理：在溶(rong)液(ye)條件(jian)下銀離子(zi)能(neng)與(yu)蛋(dan)白質(zhi)的天冬氨酸和谷氨酸上的羧基(ji)通(tong)過靜(jing)電力相結(jie)合(he)，同時銀離子(zi)還(hai)可與(yu)組(zu)氨酸、蛋(dan)氨酸、半胱氨酸和賴氨(an)酸上的咪唑(zuo)、甲硫(liu)基(ji)、巰(qiu)基(ji)和(he)氨(an)基(ji)結(jie)合(he)；接(jie)著，在堿(jian)性(xing)條件(jian)下，與(yu)蛋(dan)白質(zhi)結(jie)合(he)的銀離子(zi)在(zai)甲醛等還(hai)原劑的還(hai)原作用下生成黑(hei)褐(he)色的金(jin)屬(shu)銀使(shi)蛋(dan)白質(zhi)顯色(se)。
銀染(ran)法(fa)優點：靈(ling)敏度高，可以檢(jian)測(ce)到(dao)0.25~1ng的(de)蛋(dan)白質(zhi)，適用(yong)於(yu)低豐度(du)蛋(dan)白質(zhi)染(ran)色(se)。
銀染(ran)法(fa)缺(que)點：甲醛的(de)使(shi)用讓凝膠中蛋(dan)白化學(xue)交(jiao)聯(lian)，導(dao)致質(zhi)譜不(bu)兼容；線性(xing)範(fan)圍窄(zhai)，不(bu)太適(shi)合(he)量(liang)化；染(ran)色(se)步驟(zhou)復雜，染(ran)色(se)過程(cheng)汙(wu)染(ran)較(jiao)大，費時費力(需(xu)要8～16h)；試(shi)劑成(cheng)本(ben)較高，需(xu)要接(jie)觸(chu)有(you)毒的甲醛；而(er)且,核(he)酸、脂多(duo)糖、脂(zhi)類(lei)、醣脂類(lei)化合(he)物(wu)常(chang)會(hui)對銀染(ran)染(ran)色(se)的結(jie)果(guo)進行(xing)幹擾，導(dao)致實(shi)驗(yan)重(zhong)復率(lv)低。
負染(ran)法(fa)
1987年，LeeC等發明(ming)了蛋(dan)白質(zhi)銅負染(ran)法(fa)，只需(xu)五分(fen)鐘即可SDS-PAGE凝膠上清(qing)晰(xi)顯(xian)示6-10ng蛋(dan)白質(zhi)條帶。
蛋(dan)白質(zhi)負染(ran)法(fa)的原理是：將(jiang)金(jin)屬(shu)離子(zi)有(you)選擇地沈澱(dian)在(zai)膠面上(shang)，而(er)蛋(dan)白質(zhi)條帶不(bu)被染(ran)色(se)。因此，蛋(dan)白質(zhi)所(suo)處區(qu)域是透明(ming)的(de)，從(cong)而(er)達(da)到(dao)檢(jian)測(ce)目(mu)的(de)。該方法主要包括(kuo)KCL負染(ran)法(fa)、氯(lv)化銅負染(ran)法(fa)、氯(lv)化鋅負染(ran)法(fa)、氯(lv)化鎳負染(ran)法(fa)、醋(cu)酸鹽負染(ran)法(fa)和咪唑(zuo)鋅負染(ran)法(fa)等。
負染(ran)法(fa)的優點：操(cao)作(zuo)便捷(jie)，成本(ben)較低(di)。咪唑(zuo)鋅負染(ran)靈(ling)敏度接(jie)近於(yu)銀染(ran)法(fa)(1～10ng)，蛋(dan)白質(zhi)與(yu)鋅(xin)和咪唑(zuo)的結(jie)合(he)是可以逆(ni)轉的(de)，洗脫(tuo)後的(de)蛋(dan)白質(zhi)化學(xue)性(xing)質(zhi)沒有(you)改(gai)變，因而具(ju)有良好的(de)質(zhi)譜兼(jian)容性。
負染(ran)法(fa)的缺(que)點：對(dui)比度較(jiao)差，重(zhong)現(xian)性(xing)容易受(shou)到(dao)多(duo)種(zhong)物(wu)理(li)化(hua)學(xue)因素的影響(xiang)(例(li)如染(ran)色(se)液的pH、溫度(du)，膠中陰離(li)子(zi)的(de)濃(nong)度等)，從(cong)而限制本(ben)方法的(de)廣泛使(shi)用。
熒(ying)光(guang)染(ran)色(se)法
針(zhen)對(dui)考(kao)馬斯(si)亮(liang)蘭染(ran)色(se)雖然(ran)快速但(dan)是靈(ling)敏度不(bu)夠，銀染(ran)法(fa)雖然(ran)靈(ling)敏度高但(dan)是背(bei)景(jing)較(jiao)高，結(jie)果(guo)容易受(shou)到(dao)核(he)酸，脂類(lei)的汙染(ran)等缺(que)點,人們開(kai)始使(shi)用熒(ying)光(guang)染(ran)料對凝(ning)膠中的蛋(dan)白質(zhi)條帶進行(xing)染(ran)色(se)。
熒(ying)光(guang)染(ran)色(se)法原理是：熒(ying)光(guang)染(ran)料通(tong)過靜(jing)電作(zuo)用與(yu)SDS包裹的質(zhi)子(zi)化(hua)蛋(dan)白質(zhi)相結(jie)合(he)，搭配(pei)熒(ying)光(guang)掃描儀成像(xiang)來(lai)檢(jian)測(ce)蛋(dan)白。
熒(ying)光(guang)染(ran)色(se)法的優點(dian)：蛋(dan)白質(zhi)熒(ying)光(guang)染(ran)色(se)法具有線(xian)性(xing)範(fan)圍廣,靈(ling)敏度高(1~100ng／band)，質(zhi)譜兼(jian)容性好，適(shi)用(yong)於(yu)高通(tong)量(liang)蛋(dan)白質(zhi)組(zu)學(xue)的(de)研(yan)究。
熒(ying)光(guang)染(ran)色(se)法的缺(que)點：會(hui)用到(dao)強烈(lie)氣味和(he)刺(ci)激性(xing)的試劑，使(shi)用的(de)試(shi)劑壹般(ban)價格比較昂(ang)貴(gui)；熒(ying)光(guang)染(ran)色(se)壹般需(xu)要相對(dui)較(jiao)長(chang)的(de)處理時間，並且需(xu)要配(pei)備(bei)熒(ying)光(guang)成像掃(sao)描儀之類(lei)的特殊(shu)設備(bei)；熒(ying)光(guang)染(ran)料標(biao)記蛋(dan)白後會(hui)改(gai)變其(qi)在(zai)凝(ning)膠中的遷(qian)移(yi)性質(zhi)，不(bu)同蛋(dan)白質(zhi)樣品(pin)含(han)有(you)與(yu)熒(ying)光(guang)染(ran)料反應(ying)的氨(an)基(ji)殘(can)基(ji)不(bu)同，導(dao)致最(zui)終檢測(ce)到(dao)的(de)信號(hao)差別比較大(da)；電(dian)泳前進行(xing)染(ran)料標(biao)記容易使(shi)蛋(dan)白質(zhi)形成(cheng)發夾結(jie)構(gou)，造(zao)成(cheng)蛋(dan)白質(zhi)從凝(ning)膠向硝(xiao)酸纖維(wei)素濾膜上(shang)轉(zhuan)移(yi)時出現(xian)障(zhang)礙；此(ci)外，熒(ying)光(guang)染(ran)料的化(hua)學(xue)穩(wen)定性(xing)相對(dui)較(jiao)差、光(guang)漂白和光(guang)降解現(xian)象(xiang)比較嚴(yan)重(zhong)。以上(shang)因素導(dao)致該方法的(de)普及(ji)和(he)使(shi)用率(lv)較低(di)。
 
    蘇(su)州(zhou)阿(e)爾法生物(wu)提供熒(ying)光(guang)染(ran)料、熒(ying)光(guang)檢測(ce)儀、多(duo)功(gong)能(neng)酶標(biao)儀、凝膠成像(xiang)系(xi)統、電(dian)泳(yong)儀、電泳(yong)槽(cao)等適(shi)用於(yu)蛋(dan)白質(zhi)學(xue)、基(ji)因組(zu)學(xue)、細胞(bao)生物(wu)學(xue)等領域。更(geng)多(duo)實(shi)驗(yan)室(shi)儀器設備(bei)相關(guan)進入(ru)了解。