DNA克(ke)隆(long)技(ji)術概(gai)述

  當(dang)您聽到(dao)“克(ke)隆(long)"壹詞時(shi)，您可能(neng)會想(xiang)到(dao)克(ke)隆(long)整個生物體，例如(ru)綿羊多(duo)利。然而(er)，克(ke)隆(long)某(mou)物的全(quan)部意思(si)就是(shi)制(zhi)作(zuo)它(ta)的基(ji)因(yin)精(jing)確(que)副(fu)本(ben)。在(zai)分子(zi)生(sheng)物學(xue)實(shi)驗(yan)室中(zhong)，常被(bei)克(ke)隆(long)的(de)是基(ji)因(yin)或其他(ta)小片段(duan)DNA 稱為DNA克(ke)隆(long)。
DNA克(ke)隆(long)技(ji)術概(gai)述
 DNA 克(ke)隆(long)技(ji)術其實(shi)就(jiu)是基(ji)因(yin)編(bian)輯(ji)，是(shi)指(zhi)制作(zuo)特定(ding) DNA 片段(duan)的多(duo)個相(xiang)同(tong)副本的過(guo)程(cheng)。在典型(xing)的(de) DNA 克(ke)隆(long)過(guo)程(cheng)中(zhong)，通常(chang)會將目(mu)的(de)的基(ji)因(yin)或其他(ta) DNA 片段(duan)插入(ru)稱(cheng)為質粒的環(huan)狀 DNA 片(pian)段(duan)中(zhong)。插入(ru)是(shi)使(shi)用(yong)“剪(jian)切(qie)和粘貼(tie)"DNA 的酶(mei)完成(cheng)的(de)，它(ta)會產生壹個重組 DNA分(fen)子(zi)，或(huo)由(you)多(duo)個來源(yuan)的片(pian)段(duan)組裝而(er)成(cheng)的(de) DNA。
 質(zhi)粒 DNA 的環(huan)狀片(pian)段(duan)在其末(mo)端具有與(yu)基因(yin)片段(duan)相匹(pi)配的突出端。質粒和基(ji)因(yin)片段(duan)連接(jie)在壹起，產生含(han)有(you)基因(yin)的質粒。這種(zhong)含(han)有基因(yin)的質粒是重組 DNA 的(de)壹個例子(zi)，或(huo)由(you)多(duo)種來源(yuan)的 DNA 組裝而(er)成(cheng)的(de) DNA 分(fen)子(zi)。
 接(jie)下來，將重組質(zhi)粒引入(ru)細(xi)菌(jun)。選(xuan)擇並(bing)培(pei)養(yang)攜(xie)帶質粒的細(xi)菌(jun)。當(dang)它(ta)們繁(fan)殖(zhi)時(shi)，它(ta)們會復(fu)制(zhi)質粒並(bing)將其傳(chuan)遞給它(ta)們的(de)後代，從(cong)而(er)復(fu)制(zhi)其中(zhong)包(bao)含的(de) DNA。
在(zai)質(zhi)粒中(zhong)復制(zhi)多(duo)個 DNA 序(xu)列(lie)有什(shen)麽意義(yi)？
在(zai)某些(xie)情(qing)況(kuang)下，我(wo)們需(xu)要(yao)大量(liang) DNA 拷貝來進行實(shi)驗(yan)或構(gou)建(jian)新(xin)的(de)質粒。在其他(ta)情況下(xia)，DNA 片(pian)段(duan)編(bian)碼壹種有(you)用的(de)蛋白質(zhi)，細菌被用作制(zhi)造(zao)蛋白質(zhi)的“工廠"。例如(ru)，人(ren)類(lei)胰(yi)島(dao)素(su)基(ji)因(yin)在大腸(chang)桿菌(jun)中(zhong)表(biao)達(da)，來制造(zao)胰(yi)島(dao)素(su)。
DNA克(ke)隆(long)的(de)基本(ben)步驟(zhou)
1.切(qie)開質粒並(bing)“粘(zhan)貼(tie)"到(dao)基(ji)因(yin)中(zhong)。這個(ge)過(guo)程(cheng)依賴於限制(zhi)酶(mei)（切(qie)割 DNA）和 DNA 連(lian)接(jie)酶（連(lian)接(jie) DNA）。
2.將質(zhi)粒插入(ru)細(xi)菌(jun)。使(shi)用(yong)抗(kang)生(sheng)素(su)選(xuan)擇來識別(bie)占用質(zhi)粒的細(xi)菌(jun)。
3.培(pei)養(yang)大量(liang)攜(xie)帶質粒的細(xi)菌(jun)，並(bing)將它(ta)們用(yong)作制(zhi)造蛋白質(zhi)的“工廠"。從(cong)細(xi)菌(jun)中(zhong)收獲蛋白質(zhi)並(bing)純(chun)化(hua)。
讓(rang)我(wo)們(men)仔(zai)細(xi)看看每(mei)壹步。
1. 剪(jian)切(qie)和粘貼(tie) DNA
不(bu)同(tong)來源(yuan)的 DNA 片(pian)段(duan)如何連接(jie)在壹起？壹種常(chang)用的(de)方法(fa)使(shi)用兩種類型的酶(mei)：限(xian)制(zhi)酶和 DNA 連(lian)接(jie)酶。
限(xian)制(zhi)酶是壹種可(ke)識別(bie)特定(ding)的目(mu)標(biao)序(xu)列(lie)的DNA 切(qie)割酶，許多(duo)限制(zhi)性內切(qie)酶產生帶有短(duan)單鏈懸垂(chui)的(de)切(qie)割末端。如果(guo)兩個分子(zi)有(you)匹(pi)配的懸垂(chui)，它(ta)們可(ke)以堿基配對(dui)並(bing)粘(zhan)在(zai)壹起。然而(er)，它(ta)們不(bu)會結(jie)合(he)形成(cheng)壹個完整的 DNA 分子(zi)，直(zhi)到(dao)它(ta)們被(bei)DNA 連接(jie)酶連(lian)接(jie)起來 ，DNA 連接(jie)酶密(mi)封了 DNA 骨架(jia)中(zhong)的缺(que)口(kou)。我們克(ke)隆(long)的(de)目(mu)標(biao)是(shi)將目(mu)標(biao)基(ji)因(yin)（例如(ru)，人(ren)胰(yi)島(dao)素(su)）插(cha)入(ru)質(zhi)粒。
   我們(men)從(cong)壹個環(huan)形細(xi)菌質粒和壹個目(mu)標(biao)基(ji)因(yin)開始。目(mu)標(biao)基(ji)因(yin)的兩端是限(xian)制(zhi)位(wei)點，或(huo)特定(ding)限制酶識別(bie)的(de) DNA 序列(lie)。在質(zhi)粒中(zhong)，還(hai)有壹個被(bei)同(tong)壹種酶(mei)識別(bie)的(de)限制(zhi)性位(wei)點，就(jiu)在(zai)將驅(qu)動細菌表(biao)達(da)的(de)啟動(dong)子(zi)之(zhi)後(hou)。
   質粒和靶(ba)基(ji)因(yin)都(dou)（分別(bie)）用(yong)限制(zhi)酶消(xiao)化(hua)。純(chun)化(hua)並(bing)合(he)並(bing)片(pian)段(duan)。它(ta)們具有匹(pi)配(pei)的“粘性(xing)末端"或單(dan)鏈 DNA 懸垂(chui)，因(yin)此它(ta)們可(ke)以粘在壹起。
DNA 連接(jie)酶將具有匹(pi)配(pei)末端的片(pian)段(duan)連接(jie)在壹起，形成(cheng)壹個完整的 DNA 分子(zi)。這(zhe)會產生包(bao)含目(mu)標(biao)基(ji)因(yin)的重組質(zhi)粒。
2. 細菌(jun)轉(zhuan)化(hua)與(yu)選(xuan)擇
  質粒和其他(ta) DNA 可以在稱為轉化(hua)的(de)過(guo)程(cheng)中(zhong)引入(ru)細(xi)菌(jun)，例如(ru)實(shi)驗(yan)室中(zhong)使用(yong)的無(wu)害大腸(chang)桿菌(jun)。在(zai)轉(zhuan)化(hua)過(guo)程(cheng)中(zhong)，特別(bie)準(zhun)備的(de)細菌(jun)細(xi)胞(bao)會受到(dao)沖擊（如高溫），促(cu)使(shi)它(ta)們吸(xi)收外(wai)來 DNA。
    將通(tong)過(guo)連接(jie)產生的(de) DNA（可(ke)能(neng)是所(suo)需(xu)質(zhi)粒、副產物質粒和線(xian)性(xing) DNA 片段(duan)的混(hun)合(he)物）添(tian)加(jia)到(dao)細(xi)菌(jun)中(zhong)。細菌(jun)受到(dao)熱(re)休克(ke)，這(zhe)使它(ta)們更(geng)容(rong)易通過(guo)轉化(hua)吸(xi)收 DNA。然而(er)，只有極少(shao)數細(xi)菌能(neng)成(cheng)功地攝取質粒。
   質粒通常(chang)包(bao)含抗(kang)生(sheng)素(su)抗(kang)性(xing)基(ji)因(yin)，它(ta)允許細菌在特定(ding)抗(kang)生(sheng)素(su)存(cun)在的(de)情(qing)況(kuang)下存(cun)活。因(yin)此，可以在含有抗(kang)生(sheng)素(su)的營養(yang)平(ping)板上選(xuan)擇吸(xi)收質(zhi)粒的細(xi)菌(jun)。沒有質(zhi)粒的細(xi)菌(jun)會死(si)亡(wang)，而(er)攜(xie)帶質粒的細(xi)菌(jun)可以存(cun)活和(he)繁(fan)殖(zhi)。每(mei)壹個存(cun)活下(xia)來的細(xi)菌都(dou)會產生壹個小(xiao)的、點狀的(de)群(qun)體(ti)或菌落，它(ta)們都(dou)是相(xiang)同(tong)的細菌，它(ta)們都(dou)攜(xie)帶相同(tong)的質粒。
    並(bing)非所有菌落都(dou)必然包(bao)含正確(que)的質粒。這是(shi)因(yin)為，在連(lian)接(jie)過(guo)程(cheng)中(zhong)，DNA 片段(duan)並(bing)不(bu)總(zong)是(shi)按(an)照我(wo)們(men)預期的方(fang)式(shi)“粘貼"。相(xiang)反，我們(men)必(bi)須(xu)從(cong)幾個菌(jun)落中(zhong)收集(ji) DNA，看看每(mei)個菌(jun)落是否(fou)含有(you)正確(que)的質粒。限制(zhi)酶(mei)消(xiao)化(hua)和(he)PCR等(deng)方(fang)法(fa)通(tong)常用於檢(jian)查(zha)質(zhi)粒。
3. 蛋白質(zhi)表(biao)達(da)
   壹旦我們找到(dao)了壹個帶有正確(que)質粒的細(xi)菌(jun)菌落，我們就(jiu)可(ke)以培(pei)養(yang)大量(liang)含有(you)質(zhi)粒的細(xi)菌(jun)。然後，我(wo)們(men)給細菌(jun)壹個化(hua)學(xue)信(xin)號(hao)，指(zhi)示它(ta)們制(zhi)造目(mu)標(biao)蛋白質(zhi)。
   細菌充(chong)當(dang)微型(xing)“工廠"，大量(liang)生產蛋白質(zhi)。例如(ru)，如(ru)果我(wo)們的質(zhi)粒含有(you)人(ren)胰(yi)島(dao)素(su)基(ji)因(yin)，細菌就會開(kai)始(shi)轉錄(lu)該基(ji)因(yin)並(bing)翻(fan)譯(yi) mRNA 以產生許多(duo)人(ren)胰(yi)島(dao)素(su)蛋白質(zhi)分子(zi)。
   選(xuan)定(ding)的菌落在大型培(pei)養(yang)物（例如(ru) 1 升(sheng)培(pei)養(yang)瓶）中(zhong)長(chang)大。大型培(pei)養(yang)物中(zhong)的細(xi)菌被(bei)誘(you)導(dao)表(biao)達(da)質(zhi)粒中(zhong)包(bao)含的(de)基(ji)因(yin)，導致基(ji)因(yin)轉錄成(cheng) mRNA，然後將 mRNA 翻(fan)譯(yi)成(cheng)蛋白質(zhi)。由該基因(yin)編(bian)碼的(de)蛋白質(zhi)在細菌內部(bu)積(ji)累。
   壹旦產生了蛋白質(zhi)，細菌細胞(bao)就(jiu)可(ke)以裂開釋放出來。除(chu)了目(mu)標(biao)蛋白（如(ru)胰(yi)島(dao)素(su)）外(wai)，細菌(jun)中(zhong)還(hai)漂浮著(zhe)許多(duo)其他(ta)蛋白質(zhi)和大分子(zi)。因(yin)此，目(mu)標(biao)蛋白必(bi)須(xu)經過(guo)純(chun)化(hua)，或(huo)者(zhe)通過(guo)生化(hua)技(ji)術(shu)從(cong)細(xi)胞(bao)的(de)其他(ta)內容(rong)物中(zhong)分離出來。純(chun)化(hua)的(de)蛋白質(zhi)可用於實(shi)驗(yan)，或者(zhe)在胰(yi)島(dao)素(su)的(de)情況(kuang)下(xia)，可(ke)用於(yu)患者(zhe)。
DNA克(ke)隆(long)的(de)用途
通過(guo)克(ke)隆(long)技(ji)術構(gou)建(jian)的 DNA 分(fen)子(zi)在(zai)分(fen)子(zi)生(sheng)物學(xue)中(zhong)有多(duo)種用(yong)途。主(zhu)要(yao)包(bao)括：·
1.生(sheng)物制藥(yao)：
DNA克(ke)隆(long)可(ke)用於(yu)制造(zao)具有生(sheng)物醫學(xue)應(ying)用的(de)人(ren)類(lei)蛋白質(zhi)，例如(ru)上面提到(dao)的(de)胰(yi)島(dao)素(su)。重組蛋白的(de)其他(ta)例子(zi)包(bao)括人(ren)類(lei)生(sheng)長(chang)激素(su)，用(yong)於(yu)無法(fa)合(he)成(cheng)激素(su)的(de)患者(zhe)，以及組織(zhi)纖(xian)溶(rong)酶(mei)原(yuan)激活(huo)劑(ji) (tPA)，用(yong)於預(yu)防(fang)血栓。像這樣的重組蛋白通(tong)常是在細菌中(zhong)產生的(de)。
2.gene therapy：
 在(zai)某些(xie)遺(yi)傳(chuan)病中(zhong)，患者(zhe)缺乏(fa)特定(ding)基因(yin)的功能(neng)形式(shi)。例如(ru)，DNA 克(ke)隆(long)被(bei)用於(yu)構(gou)建(jian)含有(you)在(zai)囊性纖(xian)維(wei)化(hua)中(zhong)無功能(neng)的正常(chang)基因(yin)版本的(de)質粒。當(dang)質粒被輸(shu)送到(dao)囊性纖(xian)維(wei)化(hua)患者(zhe)的肺(fei)部(bu)時(shi)，肺功能(neng)惡化(hua)的(de)速(su)度減(jian)緩.
3.基(ji)因(yin)分析(xi)：
在基(ji)礎(chu)研(yan)究實(shi)驗(yan)室中(zhong)，生物學(xue)家(jia)經常使用 DNA 克(ke)隆(long)來構(gou)建(jian)基因(yin)的人(ren)工(gong)重組版本，以幫助他們(men)了解(jie)生物體中(zhong)正常(chang)基因(yin)的功能(neng)。
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