降低(di)CHO細(xi)胞培養(yang)中(zhong)的乳(ru)酸(suan)水(shui)平(ping)的解(jie)決方案(an)

   乳(ru)酸(suan)是CHO細(xi)胞補(bu)料分批(pi)培養(yang)的主(zhu)要(yao)副(fu)產品(pin)之壹。在 pH 控制的生(sheng)物反應(ying)器中(zhong)， 由(you)於添加(jia)堿(jian)以(yi)控制細(xi)胞培養(yang)基的 pH值，高(gao)水(shui)平(ping)乳酸(suan)的積累(lei)伴(ban)隨(sui)著高(gao)滲透(tou)壓(ya)，可(ke)能導(dao)致(zhi)制造(zao)細(xi)胞生長(chang)緩慢(man)，甚至大(da)量(liang)雕(diao)亡，同時(shi)產(chan)生抗(kang)體(ti)蛋白(bai)的產(chan)量(liang)也(ye)降低(di)不少。而 乳(ru)酸(suan)脫(tuo)氫酶(mei) (LDH) 是壹(yi)種(zhong)催(cui)化(hua)底(di)物(wu)丙(bing)酮酸(suan)轉化(hua)為(wei)乳(ru)酸(suan)的酶(mei)，包括(kuo)丙酮酸(suan)濃度(du)在內(nei)的許(xu)多因(yin)素(su)都(dou)會(hui)調節(jie) LDH 活性(xing)。
乳酸(suan)脫(tuo)氫酶(mei)對(dui)代(dai)謝(xie)產物(wu)的影(ying)響
     在壹(yi)項研究(jiu)中(zhong)，科學家們(men)曾嘗試敲(qiao)低(di)乳酸(suan)脫(tuo)氫酶(mei) A (LDHa) 和(he) PDHK 的基因(yin)表達(da)，以(yi)研究(jiu)對(dui)乳(ru)酸(suan)代謝(xie)和(he)蛋(dan)白(bai)質(zhi)生產(chan)的影(ying)響。他們(men)發(fa)現，使用攜帶 LDHa 和(he) PDHK 的小(xiao)抑制性(xing) RNA (siRNA) 的單個靶向(xiang)載(zai)體(ti)，可以(yi)成功(gong)地同時下調 LDHa 和(he) PDHK。此(ci)外(wai)，他們(men)使用 siRNA 介(jie)導的 LDHa/PDHKs 敲(qiao)低(di)克隆(long)的分(fen)批(pi)補(bu)料搖瓶(ping)評估(gu)數據(ju)顯(xian)示(shi)，在表達(da)治(zhi)療(liao)性(xing)單克隆(long)抗(kang)體(ti)的 CHO細(xi)胞中(zhong)下調 LDHa 和(he) PDHKs會(hui)減少乳(ru)酸(suan)產量(liang)，增(zeng)加(jia)比(bi)生產(chan)率(lv)和(he)體(ti)積 抗(kang)體(ti)產量(liang)分(fen)別減少約 90%、75% 和(he) 68%，對(dui)細(xi)胞生長(chang)沒(mei)有(you)明(ming)顯(xian)影(ying)響。從(cong)在(zai)生物(wu)反應(ying)器中(zhong)進行的評估(gu)中(zhong)也(ye)觀(guan)察(cha)到(dao) siRNA 克隆(long)平(ping)均(jun)較低(di)乳酸(suan)水(shui)平(ping)和(he)較(jiao)高(gao)抗(kang)體(ti)生產(chan)率(lv)的類似趨勢。
降低(di)CHO細(xi)胞培養(yang)中(zhong)的乳(ru)酸(suan)水(shui)平(ping)的方法
     生物制藥蛋白(bai)質(zhi)產品(pin)市場正(zheng)在快(kuai)速(su)增(zeng)長(chang)，在2010年(nian)時(shi)已經(jing)達(da)到(dao) 700 億美(mei)元。由(you)於對(dui)功(gong)能性(xing)蛋白(bai)質(zhi)的需(xu)求增加(jia)，需(xu)要(yao)開(kai)發(fa)技(ji)術(shu)以(yi)實現更高(gao)的生(sheng)產率(lv)。為(wei)實(shi)現這壹(yi)目(mu)標(biao)，已經(jing)在 CHO細(xi)胞中(zhong)探(tan)索了包括(kuo)宿(xiu)主(zhu)細(xi)胞工(gong)程在內(nei)的不(bu)同方法。CHO 細(xi)胞廣泛(fan)用(yong)於生(sheng)產治(zhi)療(liao)性(xing)蛋白(bai)質(zhi)，包括(kuo)在(zai)具(ju)有(you)受(shou)控 pH 值的生(sheng)物反應(ying)器中(zhong)使用分(fen)批(pi)補(bu)料工(gong)藝(yi)生(sheng)產重(zhong)組(zu)單克隆(long)抗(kang)體(ti)。乳酸(suan)是補(bu)料分批(pi)培養(yang)過(guo)程中(zhong)積累(lei)的主(zhu)要(yao)副(fu)產物之壹，已表(biao)明(ming)高(gao)乳(ru)酸(suan)水(shui)平(ping)會抑制細(xi)胞生長(chang)和(he)蛋(dan)白(bai)質(zhi)生產(chan)。    生(sheng)物(wu)反應(ying)器中(zhong)葡(pu)萄糖(tang)乳酸(suan)指標(biao)分(fen)析(xi)壹般使用EKF Biosen C-Line 乳(ru)酸(suan)分析(xi)儀(yi)來在(zai)線測定，培養過(guo)程中(zhong)多(duo)數選(xuan)用通過(guo)調節(jie)培養基中(zhong)的堿(jian)度(du)的方式來維持適(shi)宜細(xi)胞生長(chang)的PH環境(jing)。但是，乳(ru)酸(suan)分泌(mi)和(he)向(xiang)培(pei)養(yang)基中(zhong)增(zeng)加(jia)堿(jian)這(zhe)兩(liang)者(zhe)都(dou)會(hui)導致(zhi)滲透(tou)壓(ya)增(zeng)加(jia)，從(cong)而抑制細(xi)胞生長(chang)並導(dao)致(zhi)抗(kang)體(ti)生產(chan)率(lv)降低(di)。因(yin)此(ci)，降低(di)乳酸(suan)水(shui)平(ping)對(dui)於(yu)開(kai)發(fa)穩健(jian)且(qie)高(gao)效(xiao)的抗(kang)體(ti)生產(chan)過(guo)程是可(ke)取(qu)的。乳(ru)酸(suan)分泌(mi)和(he)向(xiang)培(pei)養(yang)基中(zhong)增(zeng)加(jia)堿(jian)以(yi)維持 pH 值會導致(zhi)滲透(tou)壓(ya)增(zeng)加(jia)，從(cong)而抑制細(xi)胞生長(chang)並導(dao)致(zhi)抗(kang)體(ti)生產(chan)率(lv)降低(di)。因(yin)此(ci)，降低(di)乳酸(suan)水(shui)平(ping)對(dui)於(yu)開(kai)發(fa)穩健(jian)且(qie)高(gao)效(xiao)的抗(kang)體(ti)生產(chan)過(guo)程是可(ke)取(qu)的。乳(ru)酸(suan)分泌(mi)和(he)向(xiang)培(pei)養(yang)基中(zhong)增(zeng)加(jia)堿(jian)以(yi)維持 pH 值會導致(zhi)滲透(tou)壓(ya)增(zeng)加(jia)，從(cong)而抑制細(xi)胞生長(chang)並導(dao)致(zhi)抗(kang)體(ti)生產(chan)率(lv)降低(di)。因(yin)此(ci)，降低(di)乳酸(suan)水(shui)平(ping)對(dui)於(yu)開(kai)發(fa)穩健(jian)且(qie)高(gao)效(xiao)的抗(kang)體(ti)生產(chan)過(guo)程是可(ke)取(qu)的。
     有(you)許(xu)多(duo)因(yin)素(su)會(hui)影(ying)響(xiang)哺乳動物細(xi)胞培養(yang)物中(zhong)的乳(ru)酸(suan)生成(cheng)，包(bao)括丙(bing)酮酸(suan)的細(xi)胞內(nei)濃度(du)。丙酮酸(suan)是 LDH 和(he) PDH 的底(di)物(wu)，是決(jue)定(ding)消(xiao)耗(hao)的碳(tan)源是通過(guo)糖(tang)酵解(jie)氧(yang)化(hua)後(hou)作(zuo)為(wei)乳(ru)酸(suan)排出(chu)還是在(zai) TCA 循(xun)環中(zhong)進壹步代謝(xie)的關(guan)鍵分支點。LDH 在催化(hua)丙酮酸(suan)和(he)乳(ru)酸(suan)轉化(hua)的同(tong)時也催(cui)化(hua) NADH 和(he) NAD+ 的相(xiang)互轉(zhuan)化(hua)。在哺(bu)乳動物細(xi)胞中(zhong)，LDH 以(yi)同源或異(yi)源四聚(ju)體(ti)的形式存在，主(zhu)要(yao)由(you) LDHa 和(he) LDHb 基因(yin)編碼(ma)的 A 和(he) B 亞(ya)基組(zu)成(cheng)。在 CHO 細(xi)胞中(zhong)，LDH 同(tong)種(zhong)型(xing)已被(bei)證(zheng)明(ming)是 A3B 和(he) A2B2 四(si)聚(ju)體(ti)的中(zhong)間(jian)體(ti)。

PDH 復合(he)體(ti)活性(xing)的調節(jie)方法
     PDH 復合(he)體(ti)是壹(yi)種(zhong)多(duo)酶(mei)單位，由(you)三種(zhong)催(cui)化(hua)酶(mei) E1、E2 和(he) E3 組(zu)成(cheng)。該復合(he)物催(cui)化(hua)將(jiang)丙酮酸(suan)轉化(hua)為(wei)乙(yi)酰輔(fu)酶(mei) A 的限速(su)反應(ying)，乙酰輔(fu)酶(mei) A 是三(san)羧(suo)酸(suan) (TCA) 循(xun)環的入口點。PDH 的活(huo)性(xing)受(shou) PDHK 和(he)丙(bing)酮酸(suan)脫(tuo)氫酶(mei)磷酸(suan)酶(mei) (PDHP) 的調節(jie)。PDHK 磷酸(suan)化(hua) PDH 以抑制其酶(mei)活性(xing)，而 PDHP 去(qu)磷(lin)酸(suan)化(hua)並因(yin)此(ci)激(ji)活 PDH 酶(mei)活性(xing)。哺乳(ru)動物(wu)細(xi)胞中(zhong)有(you)四(si)種(zhong) PDHK 同(tong)種(zhong)型(xing)：PDHK1、PDHK2、PDHK 3 和(he) PDHK4。這(zhe)些同種(zhong)型(xing)中(zhong)的每壹(yi)種(zhong)都(dou)具(ju)有(you)不(bu)同(tong)的組(zu)織(zhi)特異(yi)性(xing)分布(bu)。由(you)於 LDHa 和(he) PDHKs 的表(biao)達(da)都(dou)可(ke)以影響(xiang)丙(bing)酮酸(suan)水(shui)平(ping)，並且之前已經(jing)表明(ming)敲低(di) LDHa 表達(da)可(ke)以(yi)降低(di)乳酸(suan)水(shui)平(ping)，他們(men)假設如(ru)果(guo)他(ta)們(men)同時減少 LDHa 和(he) PDHKs 的表(biao)達(da)CHO 細(xi)胞中(zhong)，更多的丙(bing)酮酸(suan)可能會(hui)轉化(hua)為(wei)乙(yi)酰輔(fu)酶(mei) A，從(cong)而增(zeng)加(jia)這(zhe)些細(xi)胞中(zhong) TCA 循(xun)環產(chan)生(sheng)的能量(liang)。因(yin)此(ci)，LDHa 和(he) PDHK 的下調可能不(bu)僅會導致(zhi)乳酸(suan)減少，還(hai)會導致(zhi) CHO 細(xi)胞中(zhong)抗(kang)體(ti)產量(liang)增(zeng)加(jia)。
       在(zai)這(zhe)項(xiang)研究(jiu)中(zhong)，他(ta)們(men)證(zheng)明(ming)了使用單個 siRNA 靶向(xiang)載(zai)體(ti)可以(yi)同時(shi)降低(di) LDHa 和(he) PDHK1、2 和(he) 3 的表(biao)達(da)。當(dang)他(ta)們(men)同時降低(di) LDHa 和(he) PDHK1、2 和(he) 3 基因(yin)表達(da)，使用EKF  Biosen C-Line 乳(ru)酸(suan)分析(xi)儀(yi)進行乳(ru)酸(suan)分析(xi)後(hou)，發(fa)現不僅乳酸(suan)水(shui)平(ping)大幅(fu)降低(di)，抗(kang)體(ti)產量(liang)居(ju)然(ran)也(ye)增加(jia)了(le)不(bu)少。
構(gou)建靶(ba)向(xiang) LDHa 和(he) PDHK1、2、 3 的載(zai)體(ti)
LDHa 的靶(ba)向序列(lie)是根(gen)據(ju) Kim 和(he) Lee 的論(lun)文選(xuan)擇的，LDHa siRNA 序列(lie)是 CTCGATTCCGTTATCTGAT。為(wei)了(le)設(she)計(ji) PDHK 的 siRNA 靶(ba)向序列(lie)，CHO PDHK1、2 和(he) 3 的部分(fen) cDNA 序列(lie)通過(guo)逆(ni)轉(zhuan)錄-聚(ju)合(he)酶(mei)鏈反應(ying) (RT-PCR) 克隆(long)，引(yin)物位於(yu) PDHK 的高(gao)度(du)保守區域內(nei)，部分(fen)克隆(long)的序列(lie)也(ye)用(yong)於 siRNA 序列(lie)設(she)計(ji)。
構(gou)建靶(ba)向(xiang) PDHKs 和(he) LDHa 的 siRNA 載(zai)體(ti)
    在哺(bu)乳動(dong)物細(xi)胞中(zhong)報(bao)道了四(si)種(zhong) PDHK 基因(yin) 。為(wei)了(le)確(que)定(ding)是否(fou)所有(you)四(si)種(zhong) PDHK 基因(yin)都(dou)在(zai) CHO細(xi)胞中(zhong)表(biao)達(da)，基於(yu)人(ren)和(he)小(xiao)鼠 PDHK 序列(lie)之間的保守區域設(she)計了四(si)組 RT-PCR 引(yin)物。 PCR 結果(guo)顯(xian)示(shi)，即使在 CHO 細(xi)胞中(zhong)可(ke)以檢測(ce)到(dao)所有(you)四(si)種(zhong) PDHK mRNA，但(dan) PDHK4 mRNA 水(shui)平(ping)低(di)，並且(qie)遠(yuan)低(di)於 DHFR 缺(que)陷型 CHO 細(xi)胞中(zhong)的其他 3 種(zhong) PDHK（數據(ju)未顯(xian)示(shi)）。
    實驗已經(jing)證(zheng)明(ming)，單獨(du)降低(di) LDHa 基因(yin)表達(da)能夠(gou)減少乳(ru)酸(suan)的產(chan)生。然(ran)而，盡(jin)管乳酸(suan)水(shui)平(ping)降低(di)了 45-79%，但(dan) Qp 和(he)產(chan)物(wu)滴度(du)沒(mei)有(you)明(ming)顯(xian)改(gai)善(shan)，這表明(ming)在 CHO 細(xi)胞中(zhong)單獨(du)敲(qiao)低(di) LDHa 不足以(yi)有(you)效(xiao)提(ti)高(gao) Qp 和(he)產(chan)物(wu)產(chan)量(liang)。
       蘇(su)州阿(e)爾法生物實驗器(qi)材有(you)限公(gong)司提(ti)供CHO 細(xi)胞、CHO-S細(xi)胞、HEK、Vero細(xi)胞、幹細(xi)胞、293T等百(bai)余種(zhong)細(xi)胞系及培養基、胎(tai)牛血清、細(xi)胞培養(yang)套裝等(deng)細(xi)胞培養(yang)試劑(ji)，同(tong)時(shi)提(ti)供細(xi)胞培養(yang)生物反應(ying)器、生物發(fa)酵(jiao)罐(guan)、二氧(yang)化(hua)碳振蕩(dang)培(pei)養(yang)箱(xiang)、PCR儀(yi)、離心機(ji)、分(fen)光光度(du)計、流式(shi)細(xi)胞分析(xi)儀(yi)、細(xi)胞計數儀(yi)、細(xi)胞顯(xian)微成(cheng)像(xiang)系(xi)統和(he)用(yong)於(yu)葡(pu)萄糖(tang)-乳酸(suan)分析(xi)的EKF  Biosen C-Line 乳(ru)酸(suan)分析(xi)儀(yi)等，更多需求可進入蘇(su)州阿(e)爾法生物網站(zhan)了解(jie)。