DNA重(zhong)組(zu)實(shi)驗(yan)技術總(zong)結

DNA重(zhong)組(zu)技術，是分(fen)子(zi)的(de)生物學(xue)研究生需要(yao)掌(zhang)握的(de)實驗(yan)技術之(zhi)壹(yi)，DNA重(zhong)組(zu)實(shi)驗(yan)方(fang)法總結如下(xia)：
壹(yi)、實(shi)驗目(mu)的(de)

體外(wai)連(lian)接獲(huo)得重(zhong)組(zu)分(fen)子(zi)，用(yong)於(yu)轉化(hua)受體(ti)細胞(bao)。

二、實驗原(yuan)理(li)

DNA重(zhong)組(zu)技術是用內切(qie)酶分(fen)別將(jiang)載(zai)體和(he)外源(yuan)DNA切(qie)開，經(jing)分(fen)離純(chun)化(hua)後(hou)，用(yong)連(lian)接酶將(jiang)其(qi)連(lian)接，構(gou)成新的(de)DNA分(fen)子(zi)。

外(wai)源DNA片段和(he)質(zhi)粒載體的(de)連(lian)接反應(ying)策(ce)略(lve)有以下(xia)幾種(zhong)：

1、帶(dai)有(you)非互補(bu)突(tu)出端(duan)的(de)片段 用(yong)兩(liang)種不(bu)同的(de)限制(zhi)性(xing)內切(qie)酶進(jin)行(xing)消(xiao)化(hua)可以(yi)產生帶(dai)有(you)非互補(bu)的(de)粘(zhan)性末端(duan)，這也是最容(rong)易克隆的(de)DNA片段，壹(yi)般(ban)情況下，常用質(zhi)粒載體均(jun)帶(dai)有(you)多(duo)個(ge)不(bu)同限制(zhi)酶的(de)識別序列(lie)組(zu)成的(de)多克隆位(wei)點(dian)，因而(er)幾乎總能(neng)找到(dao)與外(wai)源(yuan)DNA片段末端(duan)匹(pi)配(pei)的(de)限制(zhi)酶切(qie)位(wei)點(dian)的(de)載體(ti)，從而(er)將(jiang)外(wai)源片段定(ding)向(xiang)地克隆到(dao)載(zai)體上(shang)。也可在(zai)PCR擴(kuo)增時，在(zai)DNA片段兩(liang)端(duan)人為加(jia)上(shang)不(bu)同酶切(qie)位(wei)點(dian)以便(bian)與載(zai)體(ti)相連(lian)。

2、帶(dai)有(you)相同的(de)粘(zhan)性末端(duan) 用相同的(de)酶或(huo)同尾(wei)酶處(chu)理可得到(dao)這(zhe)樣(yang)的(de)末端(duan)。由(you)於(yu)質(zhi)粒載體也必須(xu)用同壹(yi)種(zhong)酶消化(hua)，亦得(de)到(dao)同樣(yang)的(de)兩(liang)個(ge)相同粘(zhan)性末端(duan)，因此(ci)在(zai)連(lian)接反應(ying)中(zhong)外源(yuan)片段和(he)質(zhi)粒載體DNA均(jun)可能(neng)發生自身(shen)環化(hua)或(huo)幾個(ge)分(fen)子(zi)串(chuan)連(lian)形成寡(gua)聚(ju)物，而(er)且正(zheng)反兩(liang)種連(lian)接方(fang)向都可(ke)能(neng)有。所(suo)以，必須(xu)仔細調(tiao)整(zheng)連(lian)接反應(ying)中(zhong)兩(liang)種DNA的(de)濃(nong)度(du)，以(yi)便(bian)使(shi)正確(que)的(de)連(lian)接產物(wu)的(de)數量達(da)到(dao)hi水(shui)平(ping)。還(hai)可將(jiang)載(zai)體DNA的(de)5'磷酸基團(tuan)用(yong)堿性磷酸酯酶去(qu)掉，最(zui)大(da)限度(du)地抑制質(zhi)粒DNA的(de)自身(shen)環化(hua)。帶(dai)5'端(duan)磷酸的(de)外源(yuan)DNA片段可(ke)以(yi)有效地與去(qu)磷酸化(hua)的(de)載體(ti)相連(lian)，產生壹(yi)個(ge)帶(dai)有(you)兩(liang)個(ge)缺(que)口的(de)開環(huan)分(fen)子(zi)，在(zai)轉(zhuan)入

E.coli受體菌(jun)後(hou)的(de)擴(kuo)增過程(cheng)中(zhong)缺(que)口可自動修復(fu)。

3、帶(dai)有(you)平(ping)末端(duan) 是由(you)產生平(ping)末端(duan)的(de)限制(zhi)酶或(huo)核(he)酸(suan)外切(qie)酶消化(hua)產生，或(huo)由(you)DNA聚(ju)合酶補(bu)平(ping)所(suo)致。由(you)於(yu)平(ping)端(duan)的(de)連(lian)接效(xiao)率比粘(zhan)性末端(duan)要低得多(duo)，故在(zai)其(qi)連(lian)接反應(ying)中(zhong)，T

₄ DNA連(lian)接酶的(de)濃(nong)度(du)和(he)外源(yuan)DNA及(ji)載體(ti)DNA濃(nong)度(du)均(jun)要(yao)高得(de)多(duo)。通常還(hai)需加入低濃(nong)度(du)的(de)聚(ju)乙二醇(PEG 8000)以促(cu)進(jin)DNA分(fen)子(zi)凝(ning)聚(ju)成聚(ju)集(ji)體的(de)物質(zhi)以提(ti)高轉化(hua)效率。

特(te)殊情況下，外(wai)源DNA分(fen)子(zi)的(de)末端(duan)與所(suo)用(yong)的(de)載體(ti)末端(duan)無法(fa)相互(hu)匹(pi)配(pei)，則可(ke)以在(zai)線(xian)狀(zhuang)質(zhi)粒載體末端(duan)或(huo)外(wai)源(yuan)DNA片段末端(duan)接上(shang)合(he)適的(de)接頭(linker)或(huo)銜(xian)接頭(adapter)使(shi)其匹(pi)配(pei)， 也可以有(you)控制(zhi)的(de)使(shi)用E. coli DNA聚(ju)合酶Ⅰ的(de)klenow大(da)片段部分(fen)填平(ping)3'凹(ao)端(duan)，使(shi)不相匹(pi)配(pei)的(de)末端(duan)轉變(bian)為互(hu)補(bu)末端(duan)或(huo)轉(zhuan)為平(ping)末端(duan)後(hou)再(zai)進(jin)行(xing)連(lian)接。

三、 主要試(shi)劑(ji)

　  T

₄ 連(lian)接酶、無菌(jun)水(shui)、質(zhi)粒和(he)PCR的(de)酶切(qie)產物(wu)。
四(si)、儀(yi)器耗(hao)材(cai)

　  微量移(yi)液(ye)槍(qiang)，Tip頭、PCR反應(ying)管(guan)、低溫水(shui)浴(yu)鍋。

五、 連(lian)接反應(ying)　　　

質(zhi)粒酶切(qie)產物(wu)    1

PCR酶切(qie)產物(wu)    4

T

₄ ligase         1

10×bf           1

H

₂O            3

-------------------------------

Total          10 μL

六(liu)、註意事(shi)項(xiang)

1. 操作(zuo)時，註意保(bao)持(chi)低溫狀態，因(yin)為Ligase酶很容(rong)易降(jiang)解(jie)。

2. 連(lian)接反應(ying)，壹(yi)般(ban)14-16℃，O/N.

蘇州阿(e)爾(er)法生物14年專註於(yu)  微量(liang)移(yi)液(ye)槍(qiang)，Tip頭、PCR反應(ying)管(guan)、水(shui)浴(yu)鍋、實驗室(shi)冰(bing)箱等(deng)實(shi)驗室儀(yi)器和(he)耗(hao)材(cai)供(gong)應(ying)以(yi)及(ji) T₄ 連(lian)接酶、無菌(jun)水(shui)、質(zhi)粒提(ti)取試劑(ji)盒(he)、DNA提(ti)取試劑(ji)盒(he)，更多(duo)PCR相關(guan)內容(rong)進(jin)入(ru)蘇(su)州阿(e)爾(er)法生物實(shi)驗(yan)器材網站(zhan)了解(jie)。