PCR儀使用參數(shu)設(she)定(ding)註意(yi)事項

PCR儀使用參數(shu)設(she)定(ding)不(bu)正(zheng)確會(hui)影響到(dao)PCR實(shi)驗結(jie)果(guo)，這(zhe)主要(yao)表現(xian)在溫(wen)度(du)、時(shi)間(jian)和循環次(ci)數(shu)上，如果(guo)溫(wen)度(du)參(can)數(shu)設(she)置過(guo)高，延伸時(shi)間(jian)不(bu)夠都會(hui)對實(shi)驗結(jie)果(guo)造(zao)成(cheng)影響，下面(mian)談談使用PCR儀參數(shu)設(she)定(ding)時(shi)的(de)註意(yi)事項：

壹、溫度(du)和時(shi)間(jian)

溫(wen)度(du)與(yu)時(shi)間(jian)的(de)設(she)置： 基(ji)於PCR原理(li)三步(bu)驟(zhou)而設(she)置變(bian)性(xing)-退(tui)火-延(yan)伸(shen)三(san)個(ge)溫(wen)度(du)點(dian)。在標(biao)準反(fan)應中采用三溫(wen)度(du)點(dian)法(fa)，雙(shuang)鏈DNA在90～95℃變(bian)性(xing)，再(zai)迅(xun)速(su)冷(leng)卻至(zhi)40 ～60℃，引(yin)物(wu)退火(huo)並結(jie)合(he)到靶序(xu)列(lie)上，然後快速(su)升溫(wen)至(zhi)70～75℃，在Taq DNA 聚(ju)合(he)酶(mei)的(de)作(zuo)用下，使引物(wu)鏈沿模板延(yan)伸(shen)。對於較短(duan)靶基(ji)因(長度(du)為100～300bp時(shi))可采用二溫(wen)度(du)點(dian)法(fa)，除變性(xing)溫(wen)度(du)外、退(tui)火(huo)與(yu)延伸(shen)溫度(du)可合二為壹，壹般采用94℃變性(xing)，65℃左(zuo)右退(tui)火與(yu)延伸(shen)(此溫(wen)度(du)Taq DNA酶(mei)仍(reng)有較高的(de)催化(hua)活(huo)性(xing))。

①變(bian)性(xing)溫(wen)度(du)與(yu)時(shi)間(jian)

  變(bian)性(xing)溫(wen)度(du)低(di)，解(jie)鏈不(bu)完整(zheng)是導致(zhi)PCR失敗(bai)的(de)最主要(yao)原因。壹般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變(bian)性(xing)，若(ruo)低於93℃則需(xu)延長時(shi)間(jian)，但(dan)溫(wen)度(du)不(bu)能過高，因為高溫環境(jing)對酶的(de)活(huo)性(xing)有(you)影響。此(ci)步(bu)若(ruo)不能使靶基(ji)因模板或(huo)PCR產(chan)物(wu)全變(bian)性(xing)，就(jiu)會(hui)導致(zhi)PCR失敗(bai)。

②退火(huo)(復性(xing))溫(wen)度(du)與(yu)時(shi)間(jian)

退(tui)火(huo)溫(wen)度(du)是(shi)影響PCR特(te)異(yi)性(xing)的(de)較重(zhong)要(yao)因素(su)。變性(xing)後(hou)溫度(du)快速(su)冷(leng)卻至(zhi)40℃～60℃，可使引物(wu)和模板發(fa)生(sheng)結合(he)。由於模板DNA 比(bi)引(yin)物(wu)復雜(za)得(de)多，引(yin)物(wu)和模板之間(jian)的(de)碰(peng)撞(zhuang)結(jie)合(he)機會(hui)遠(yuan)遠(yuan)高於模板互(hu)補(bu)鏈之間(jian)的(de)碰(peng)撞(zhuang)。退(tui)火(huo)溫度(du)與(yu)時(shi)間(jian)，取(qu)決於引物(wu)的(de)長度(du)、堿基(ji)組成(cheng)及(ji)其濃度(du)，還(hai)有靶基(ji)序(xu)列(lie)的(de)長度(du)。對於20個核苷(gan)酸(suan)，G+C含量(liang)約(yue)50%的(de)引物(wu)，55℃為選擇最適(shi)退火(huo)溫(wen)度(du)的(de)起點(dian)較為理(li)想(xiang)。引物(wu)的(de)復性(xing)溫(wen)度(du)可通過(guo)以(yi)下公式(shi)幫(bang)助(zhu)選(xuan)擇合適(shi)的(de)溫度(du)：

Tm值(zhi)(解(jie)鏈溫(wen)度(du))=4(G+C)＋2(A+T)

復(fu)性(xing)溫(wen)度(du)=Tm值(zhi)-(5～10℃)

在Tm值(zhi)允(yun)許範(fan)圍(wei)內(nei)， 選擇(ze)較高的(de)復性(xing)溫(wen)度(du)可大大減(jian)少引(yin)物(wu)和模板間(jian)的(de)非(fei)特(te)異(yi)性(xing)結(jie)合，提高PCR反應的(de)特(te)異(yi)性(xing)。復(fu)性(xing)時(shi)間(jian)壹般為30～60sec，足以使引物(wu)與(yu)模板之間(jian)相(xiang)結(jie)合(he)。

③延伸溫(wen)度(du)與(yu)時(shi)間(jian)

Taq DNA聚(ju)合(he)酶(mei)的(de)生(sheng)物(wu)學活(huo)性(xing)：

70～80℃ 150核苷(gan)酸(suan)/S/酶分(fen)子(zi)

70℃ 60核苷(gan)酸(suan)/S/酶分(fen)子(zi)

55℃ 24核苷(gan)酸(suan)/S/酶分(fen)子(zi)

高於90℃時(shi)， DNA合(he)成(cheng)幾(ji)乎(hu)不能進行(xing)。

PCR反(fan)應的(de)延伸(shen)溫(wen)度(du)壹般選(xuan)擇(ze)在70～75℃之間(jian)，常(chang)用溫度(du)為72℃，過高的(de)延伸(shen)溫(wen)度(du)不(bu)利(li)於引物(wu)和模板的(de)結合(he)。PCR延(yan)伸反(fan)應的(de)時(shi)間(jian)，可根據(ju)待擴(kuo)增片(pian)段(duan)的(de)長度(du)而(er)定(ding)，壹般1Kb以(yi)內(nei)的(de)DNA片(pian)段(duan)，延(yan)伸(shen)時(shi)間(jian)1min是(shi)足夠的(de)。3～4kb的(de)靶序(xu)列(lie)需(xu)3～4min；擴(kuo)增10Kb需(xu)延伸(shen)至(zhi)15min。延(yan)伸(shen)進(jin)間(jian)過(guo)長會(hui)導致(zhi)非(fei)特(te)異(yi)性(xing)擴(kuo)增帶(dai)的(de)出(chu)現(xian)。對低濃度(du)模板的(de)擴(kuo)增，延(yan)伸時(shi)間(jian)要(yao)稍(shao)長些(xie)。

二、循(xun)環次(ci)數(shu)

 循環(huan)次(ci)數(shu)決定(ding)PCR擴(kuo)增程(cheng)度(du)。PCR循(xun)環(huan)次(ci)數(shu)主要(yao)取決於模板DNA的(de)濃度(du)。壹般的(de)循環(huan)次(ci)數(shu)選在30～40次(ci)之間(jian)，循(xun)環(huan)次(ci)數(shu)越(yue)多，非(fei)特(te)異(yi)性(xing)產(chan)物(wu)的(de)量也(ye)隨(sui)之增(zeng)多。
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