壹種通過改造(zao)CHO 細胞提升抗體(ti)產量(liang)的新(xin)技(ji)術

丙(bing)酮(tong)酸羧(suo)化(hua)酶(mei)是(shi)細胞質和線粒體(ti)代(dai)謝途(tu)徑(jing)的重(zhong)要元素(su)，可以(yi)有(you)效促進能量(liang)代(dai)謝。在(zai) CHO 細胞中過表達酵母(mu)胞質丙酮(tong)酸羧(suo)化(hua)酶(mei) (PYC2)，可(ke) 以(yi)增加丙(bing)酮(tong)酸流(liu)向(xiang) TCA 循環。增強(qiang)的 PYC2 表達導致丙(bing)酮(tong)酸通(tong)量(liang)增加，從而使乳酸積(ji)累減少多達 4 倍，並(bing)顯著(zhe)增加細胞密(mi)度和培養壽(shou)命(ming)。有(you)了(le)這(zhe)個(ge)結果，與(yu)親(qin)本細胞相比(bi)，工(gong)程(cheng)細胞的抗體(ti)表達顯著(zhe)提(ti)高了(le) 70%，產品(pin)質量(liang)也有(you)所(suo)提高(gao)（約 3 倍）。通過 PYC2 工(gong)程(cheng) 改造(zao)提(ti)升細胞性能，在(zai)丙(bing)酮(tong)酸、葡(pu)萄(tao)糖(tang)、乳酸和細胞能量(liang)代(dai)謝方(fang)面具(ju)有(you)均高(gao)於(yu)親(qin)代(dai)細胞的各種(zhong)優勢。
PYC2 工(gong)程(cheng)改造(zao)原(yuan)理(li)和方法(fa)
在補(bu)料(liao)分批上(shang)遊工(gong)藝(yi)中，產生(sheng)抗體(ti)的 CHO 細胞需(xu)要持(chi)續提(ti)供碳、氮(dan)、能量(liang) (ATP) 和還原(yuan)劑 (NADPH) 以(yi)維持(chi)其(qi)合成代(dai)謝功能。 由(you)於(yu)培養基消耗(hao)糖(tang)酵解(jie)過(guo)程(cheng)會(hui)產生(sheng)乳酸和氨(an)等不需(xu)要的廢(fei)物(wu)，這(zhe)些物(wu)質積(ji)累，會阻礙細胞生長以(yi)及重(zhong)組產品(pin)的產品(pin)質量(liang)屬(shu)性。
糖(tang)酵解(jie)是(shi)葡(pu)萄(tao)糖(tang)被氧(yang)化(hua)的主(zhu)要分解代(dai)謝途(tu)徑(jing)，最後，壹分子葡(pu)萄(tao)糖(tang)轉(zhuan)化(hua)為兩(liang)分子丙酮(tong)酸，然(ran)後進入線粒體(ti)並(bing)在(zai) TCA 循環中被氧(yang)化(hua)。CHO 細胞在補(bu)料(liao)分批模(mo)式下的細胞代謝需(xu)要高速(su)率的糖(tang)酵解(jie)，從而觸(chu)發(fa)丙(bing)酮(tong)酸的積(ji)累。由(you)於(yu)線粒體(ti)和胞質代謝系統(tong)的連(lian)通性(xing)差(cha)，大部(bu)分積(ji)累的丙(bing)酮(tong)酸通(tong)量(liang)驅(qu)動乳酸脫(tuo)氫酶 (LDH) 產生(sheng)乳酸. 乳酸的測(ce)定(ding)壹般使(shi)用(yong)EKF Biosen C-Line 來(lai)進行葡(pu)萄(tao)糖(tang)乳酸分析(xi)。
迄今(jin)為止(zhi)，已(yi)經嘗(chang)試(shi)了(le)多種方(fang)法(fa)來(lai)使(shi)用(yong)生產宿主(zhu)的代(dai)謝工(gong)程(cheng)或細胞培養過(guo)程(cheng)的過(guo)程(cheng)工(gong)程(cheng)來(lai)減(jian)少(shao)細胞培養廢(fei)物(wu)。比(bi)如使用(yong)半乳糖(tang)或丙酮(tong)酸替(ti)代葡(pu)萄(tao)糖(tang)，或用(yong)天(tian)冬酰胺或谷氨(an)酸替(ti)代谷氨(an)酰胺。調(tiao)節(jie)細胞系統(tong)代謝途(tu)徑(jing)中涉(she)及的酶(mei)來(lai)減(jian)少(shao)廢(fei)物(wu)積(ji)累也是(shi)壹種不錯(cuo)的選(xuan)擇。
PYC2 工(gong)程(cheng)改造(zao)是(shi)通過在哺(bu)乳動(dong)物(wu)細胞 BHK 和 HEK293 細胞中表達胞質酵母(mu)丙(bing)酮(tong)酸羧(suo)化(hua)酶(mei) 2 (PYC2) 基因來(lai)減(jian)少(shao)乳酸積(ji)累，從而增加蛋(dan)白質(zhi)產量(liang)或改善細胞生長， 實驗(yan)證(zheng)明(ming)，在(zai) CHO 細胞中過表達 PYC2 可以(yi)延長細胞培養時(shi)間(jian)，並(bing)將(jiang)乳酸/葡(pu)萄(tao)糖(tang)比(bi)率降低 25%，但(dan)是，比(bi)生(sheng)產率降低 50%，從而影響(xiang)整體(ti)體(ti)積(ji)抗體(ti)表達。主要方法(fa)是通(tong)過(guo) PYC2 改造(zao)的細胞庫的異(yi)源(yuan)群(qun)體(ti)中篩選(xuan) PYC2 改造(zao)的 CHO 克(ke)隆。隨(sui)後，根據(ju)培養性(xing)能(neng)及其(qi)代(dai)謝特征從 PYC2 克隆組(zu)中選擇單細胞克隆。基於(yu)各種(zhong)生化(hua)和代謝分析(xi)，建(jian)立(li)了(le)壹個(ge)代(dai)謝控(kong)制(zhi)的 CHO 平(ping)臺(tai)，該(gai)平(ping)臺(tai)具(ju)有(you)增強(qiang)的 PYC2 基因負(fu)載，並(bing)且(qie)能(neng)夠在較高(gao)的細胞密(mi)度、高葡(pu)萄(tao)糖(tang)消(xiao)耗(hao)率和降低(di)的乳酸的分批補(bu)料(liao)過(guo)程(cheng)中維持(chi)較長時(shi)間(jian)積(ji)累。
PYC2 工(gong)程(cheng)的細胞庫生(sheng)成和細胞系開(kai)發(fa)
   為了(le)增強(qiang)細胞代謝並(bing)改善細胞溶質和線粒體(ti)代(dai)謝途(tu)徑(jing)，我們通(tong)過(guo)增加 CHO 細胞池中的 PYC2 基因負(fu)荷(he)來(lai)改造(zao) CHO 細胞系統(tong)。在這(zhe)項研(yan)究(jiu)中，我們(men)使(shi)用(yong)密(mi)碼(ma)子優化(hua)（針(zhen)對(dui) CHO）酵母(mu)丙(bing)酮(tong)酸羧(suo)化(hua)酶(mei) (PYC2) 基因，該(gai)基因在(zai) CHO 細胞的胞質溶膠(jiao)中表達。PYC2 通過將(jiang)細胞溶質丙(bing)酮(tong)酸驅(qu)向(xiang)代謝途(tu)徑(jing)的克(ke)雷伯循環，在(zai)控制(zhi)丙(bing)酮(tong)酸積(ji)累方面發(fa)揮(hui)關鍵作用(yong)"。增加表達代謝優化(hua) PYC2 基因的基因拷(kao)貝可有(you)效觸(chu)發(fa)丙(bing)酮(tong)酸流(liu)向(xiang)線粒體(ti)代(dai)謝途(tu)徑(jing)，並(bing)將(jiang)糖(tang)酵解(jie)與(yu) TCA 循環聯(lian)系起來(lai)，以(yi)增強(qiang)內部細胞能量(liang)代(dai)謝。 
    通(tong)過(guo)使用(yong)氖電(dian)穿(chuan)孔(kong)法(fa)，用(yong)帶(dai)有(you) PYC2 基因的質(zhi)粒 pMPYC 轉染(ran) CHO-S 細胞（懸浮液(ye)），並(bing)產生(sheng)穩(wen)定(ding)的細胞庫。為了(le)從轉染池(chi)中篩選(xuan)出(chu)所(suo)需(xu)的 CHO 克(ke)隆，我(wo)們應用(yong)了(le)兩(liang)階(jie)段(duan)選(xuan)擇方案，其(qi)中我們(men)使(shi)用(yong)不同(tong)濃(nong)度的選(xuan)擇劑嘌(piao)呤(ling)黴(mei)素(su)和 MTX 生成了(le)轉(zhuan)染的 CHO 細胞群(qun). 選擇壓力從低濃(nong)度逐(zhu)漸增加到(dao)高濃(nong)度，通過消除源(yuan)自(zi)高度異質性群(qun)體(ti)的不(bu)良細胞/克隆，可(ke)以(yi)嚴格選擇所(suo)需(xu)的細胞庫。選(xuan)定(ding)的池(chi)具(ju)有(you)混合的轉(zhuan)染 PYC2-CHO 細胞群(qun)，這(zhe)些細胞含有(you)不同(tong)的 PYC2 基因拷(kao)貝，並(bing)且(qie)還(hai)由(you)於(yu)隨(sui)機(ji)整(zheng)合事(shi)件以(yi)及 CHO 基因組(zu)中的位(wei)置效(xiao)應而改變 PYC2 表達模(mo)式。為了(le)評估(gu)每個(ge)池(chi)的代(dai)謝性(xing)能(neng)，我們(men)進壹步(bu)選(xuan)擇了(le)池(chi) 1B、1C 和 2D 來(lai)評估(gu) PYC2 表達效率，隨後使用(yong) CD-Forti-CHO 基礎培養基和nest搖(yao)瓶(ping)進行了(le)補(bu)料(liao)分批培養實(shi)驗(yan)。實驗(yan)中評估(gu)了(le)代(dai)謝特征（乳酸和葡(pu)萄(tao)糖(tang)），細胞活力和生長模(mo)式從細胞周期的指數期到(dao)穩定(ding)期，並(bing)將(jiang)幾(ji)個(ge)重(zhong)要參(can)數與(yu)親(qin)代(dai) CHO 細胞（未轉染(ran)）進行了(le)比(bi)較。

實(shi)驗(yan)結論
    通(tong)過觀(guan)察，pool 1B（選自(zi) Phase I，含有(you) 200nM MTX 和 20ug/ml Puromycin），pool 1C（選自(zi) phase II，含有(you) 500nM MTX 和 30ug/ml Puromycin）和 pool 2D（選自(zi) phase II，含有(you)1000nM MTX 和 50ug/ml Puromycin）在細胞活力和細胞密(mi)度分布方(fang)面顯示(shi)出(chu)它們之間(jian)以(yi)及與(yu)親(qin)代(dai) CHO 細胞的顯著(zhe)差(cha)異。在池(chi) 1B 中，達到(dao)的峰(feng)值(zhi)細胞密(mi)度高達 2000 萬個(ge)細胞/mL，但(dan)是，細胞活力從第 10 天(tian)開(kai)始(shi)下(xia)降，並(bing)在(zai)第(di) 14 天(tian)達到(dao)約 72%，而池 1C 顯示(shi)細胞密(mi)度高達 2300 萬個(ge)細胞/mL，並(bing)且(qie)活(huo)力(li)從第 11 天(tian)開(kai)始(shi)下(xia)降，並(bing)在(zai)同(tong)壹天(tian)（第 14 天(tian)）達到(dao)約 83%。相(xiang)比(bi)之(zhi)下(xia)，從最高濃(nong)度的選(xuan)擇劑中選出(chu)的 2D 池(chi)顯示(shi)出(chu)顯著(zhe)延長的細胞活力以(yi)及池中最高(gao)的細胞密(mi)度（圖 1B 和 1C）。在池(chi) 2D 中，達到(dao)的峰(feng)值(zhi)細胞密(mi)度約為 2600 萬個(ge)細胞/mL，第 14 天(tian)的細胞活力約(yue)為 92%，比(bi)包(bao)括親(qin)代(dai) CHO 細胞在內的其(qi)他(ta)兩(liang)個(ge)池(chi)（圖 1B 和 1C）高10-20 %，如上所(suo)述. 此外，我(wo)們(men)分析(xi)了(le)細胞在乳酸積(ji)累和消耗(hao)率方面的代(dai)謝行為，發(fa)現與(yu)其(qi)余(yu)池(chi)和親(qin)代(dai)細胞相比(bi)，2D 池(chi)在(zai)乳酸代(dai)謝方(fang)面存(cun)在(zai)顯著(zhe)差(cha)異。池 2D 和 1C 以(yi)及池 1B 和親(qin)代(dai) CHO 細胞的乳酸譜彼(bi)此相似(si)，但(dan)是，池(chi) 2D 的乳酸產量(liang)顯著(zhe)降(jiang)低（圖 1D）與(yu)其(qi)他(ta)細胞池相比(bi)。由(you)於(yu)這(zhe)些池具(ju)有(you)不同(tong) PYC2 基因負(fu)載的異(yi)質細胞群(qun)，並(bing)且(qie)在(zai)補(bu)料(liao)分批培養期間(jian)，異(yi)質群(qun)的累(lei)積(ji)效應顯示(shi)細胞活力、密(mi)度和乳酸譜的變(bian)化(hua)，因(yin)此我們(men)選(xuan)擇 2D 池作為後續池(chi)的最(zui)終池單(dan)細胞克隆、篩選(xuan)和建(jian)立(li)潛(qian)在的工(gong)程(cheng)細胞候選者(zhe)。單(dan)細胞分選是(shi)使用(yong) Guava® Muse-細胞分析(xi)儀通過(guo)為活(huo)的和良好的邊(bian)緣/邊緣細胞形(xing)狀(zhuang)設(she)置有(you)效門(men)控來(lai)進行的（圖 1E）。細胞分選在(zai)白色(se)背(bei)景(jing)下(xia)進行，不使(shi)用(yong)任何(he)標(biao)記(ji)試(shi)劑/抗體(ti)。分選的單(dan)細胞最初在(zai) 384 孔(kong)板(ban)中生長，並(bing)通(tong)過(guo)使(shi)用(yong) ZenCELL  innoME 活細胞動態成像(xiang)分析(xi)儀在從第 0 天(tian)到(dao)第 17 天(tian)的不(bu)同時(shi)間(jian)間(jian)隔進壹步(bu)監(jian)測(ce)它們的生(sheng)長模(mo)式（圖1F）。根(gen)據(ju)細胞/克隆的形(xing)態、生長和克隆性(xing)，我們挑出(chu)那些僅(jin)來(lai)源(yuan)於(yu)單(dan)個(ge)細胞的菌落(luo)（通(tong)過(guo)細胞成像(xiang)儀確認(ren)），然後將選定(ding)的菌落(luo)轉(zhuan)移(yi)並(bing)從低體(ti)積(ji)逐(zhu)漸擴(kuo)大到(dao)高體(ti)積(ji)按照材料和方法(fa)（ 圖 1E 和 1F）中的描(miao)述(shu)，進入多孔板(ban)，然(ran)後進入 T-25 燒(shao)瓶(ping) . PYC2 克隆 #12 的克(ke)隆穩(wen)定(ding)性(xing)研(yan)究(jiu)還在補(bu)充(chong)有(you) 6mM 谷氨(an)酰胺（搖(yao)瓶(ping)）的基礎培養基 CD-Forti-CHO 中進行了(le) 70 代(dai)，有(you)和沒(mei)有(you)選擇壓力，發(fa)現穩(wen)定(ding)性(xing)長達 50 代(dai)。
         蘇州阿爾(er)法提(ti)供(gong)CHO、HEK、Vero細胞、間(jian)充(chong)質(zhi)幹細胞、293T、RAW264.7細胞、H9C2細胞等百余(yu)種(zhong)細胞系及培養基、胎牛血清(qing)、細胞培養套裝(zhuang)等細胞培養試(shi)劑，同(tong)時(shi)提(ti)供(gong)細胞培養生(sheng)物(wu)反應器(qi)、生物(wu)發酵罐(guan)、二(er)氧(yang)化(hua)碳振(zhen)蕩培養箱(xiang)、PCR儀、離心機(ji)、分光光(guang)度計、流(liu)式細胞分析(xi)儀、細胞計數儀、細胞顯微成像(xiang)系統(tong)和用(yong)於(yu)葡(pu)萄(tao)糖(tang)-乳酸分析(xi)的EKF  Biosen C-Line 乳酸分析(xi)儀等，更多需(xu)求(qiu)可進入蘇州阿爾(er)法生(sheng)物(wu)實驗(yan)器材(cai)有(you)限公(gong)司(si)了(le)解(jie)。