核(he)酸酶(mei)切(qie)反(fan)應原(yuan)理及(ji)註意事項(xiang)

A 載體和(he)外(wai)源DNA的(de)酶(mei)切(qie)

壹、實驗目的(de)

學習和(he)掌握(wo)核(he)酸的(de)酶(mei)切(qie)操(cao)作(zuo)原理(li)；通(tong)過酶(mei)切獲(huo)得可(ke)進行體外(wai)重(zhong)組的(de)載(zai)體和(he)外(wai)源DNA。

二、實驗原(yuan)理(li)

限制性內(nei)切酶(mei)能(neng)特(te)異地結合(he)於(yu)壹段(duan)被稱為限(xian)制性酶(mei)識(shi)別(bie)序列的(de)DNA序列之內(nei)或(huo)其(qi)附(fu)近(jin)的(de)特(te)異位(wei)點上，並(bing)切割雙(shuang)鏈DNA。絕(jue)大多數限(xian)制酶識(shi)別(bie)長度(du)為(wei)4至(zhi)6個核(he)苷(gan)酸的(de)回文(wen)對(dui)稱特異核(he)苷(gan)酸序(xu)列(lie)(如(ru)EcoRⅠ識(shi)別(bie)六個核(he)苷(gan)酸序(xu)列(lie)：5'- G↓AATTC-3')，有少數酶(mei)識(shi)別(bie)更長的(de)序(xu)列(lie)或(huo)簡(jian)並(bing)序列。Ⅱ類酶(mei)切(qie)割位(wei)點在識(shi)別(bie)序列中(zhong)，有的(de)在對(dui)稱軸處切割，產生平末端的(de)DNA片段(如(ru)SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3')；有的(de)切(qie)割(ge)位(wei)點(dian)在對(dui)稱軸壹(yi)側，產生帶有單(dan)鏈突(tu)出末端的(de)DNA片段稱粘性未(wei)端，如(ru)EcoRⅠ切割識(shi)別(bie)序列5'…G↓AATTC…3' 後(hou)產生兩個互補(bu)的(de)粘(zhan)性末端。

限制性內(nei)切酶(mei)的(de)酶(mei)解(jie)反(fan)應最(zui)適條(tiao)件各不(bu)相(xiang)同(tong)，各(ge)種酶(mei)有其(qi)相(xiang)應(ying)的(de)酶(mei)切(qie)緩(huan)沖(chong)液和(he)最適反(fan)應溫(wen)度(du)(大多數為(wei)37℃)。對(dui)質粒(li)DNA酶切反(fan)應而(er)言， 限(xian)制性內(nei)切酶(mei)用量(liang)可(ke)按(an)標準體系1μg DNA加(jia)1單(dan)位(wei)酶(mei)，消(xiao)化1-2小時(shi)。但酶解(jie)必須(xu)增加(jia)酶的(de)用(yong)量(liang)，壹(yi)般(ban)增加(jia)2-3倍，甚至(zhi)更(geng)多，反(fan)應時(shi)間(jian)也(ye)要適當(dang)延(yan)長。

酶活力(li)通(tong)常用酶(mei)單(dan)位(wei)（U）表示，酶(mei)單(dan)位(wei)的(de)定(ding)義(yi)是：在最(zui)適反(fan)應條(tiao)件下(xia)，1小時(shi)降(jiang)解(jie)1mg λDNA的(de)酶(mei)量(liang)為(wei)壹(yi)個單(dan)位(wei)，但是許(xu)多實驗制備的(de)DNA不(bu)象(xiang)λDNA那樣易於(yu)降(jiang)解(jie)，需(xu)適當(dang)增(zeng)加(jia)酶的(de)使(shi)用(yong)量(liang)。反(fan)應液(ye)中(zhong)加(jia)入(ru)過量(liang)的(de)酶(mei)是(shi)不(bu)合適的(de)，除(chu)考慮成(cheng)本外(wai)，酶液中(zhong)的(de)微(wei)量(liang)雜(za)質(zhi)可(ke)能(neng)幹(gan)擾(rao)隨(sui)後(hou)的(de)反(fan)應。         

三(san)、主(zhu)要(yao)試(shi)劑(ji)

質粒(li)pET30a、EcoRⅠ、HindⅢ、DNA產物(wu)純化kit、無菌水、乙醇(chun)、瓊(qiong)脂糖(tang)、溴酚藍(lan)、TAE、EB、DNA marker、NaAc

四、儀器耗(hao)材(cai)

水浴鍋(guo)、滅(mie)菌鍋(guo)、離(li)心(xin)機(ji)、電泳儀、電泳槽、凝(ning)膠成(cheng)像(xiang)儀(yi)、移液槍(qiang)壹(yi)套(tao)、微波(bo)爐。

五、酶切反(fan)應  

反(fan)應體系 1.     質粒(li)        3      

                    bf          2

                    EcoRⅠ      1      (10U/μL)

                    Hind Ⅲ     1      (10U/μL)

                    H₂O        13

               ---------------------------------------

                    Total       20 μL

     反(fan)應體系 2.    PCR產物(wu)   10     (50ng/μL)    （回收(shou)後(hou)的(de)PCR產物(wu)）

                    bf          5

                    EcoRⅠ      1     (10U/μL)

                    Hind Ⅲ     1     (10U/μL)

                    H₂O        33

               ----------------------------------------

                   Total       50 μL

37℃，2-4hr； 65℃，10min，終(zhong)止(zhi)反(fan)應。

質粒(li)載體酶解液，瓊(qiong)脂(zhi)糖(tang)膠(jiao)電泳檢(jian)測(ce)。切膠(jiao)回收(shou)。

PCR產物(wu)酶(mei)切後(hou)不(bu)用回收(shou)，直接用(yong)於(yu)連(lian)接。可(ke)以電泳檢(jian)測(ce)回收(shou)效(xiao)果。

六、註意事項(xiang)

1、 DNA純度(du)、緩(huan)沖(chong)液(ye)、溫(wen)度(du)條(tiao)件及限制性內(nei)切酶(mei)本身(shen)都(dou)會影(ying)響限(xian)制性內(nei)切酶(mei)的(de)活性。大部(bu)分(fen)限制性內(nei)切酶(mei)不(bu)受RNA或單(dan)鏈DNA的(de)影(ying)響。當(dang)微(wei)量的(de)汙(wu)染物(wu)進入(ru)限(xian)制性內(nei)切酶(mei)貯存液(ye)中(zhong)時(shi)，會(hui)影(ying)響其(qi)進壹步使(shi)用(yong)，因此在吸取限制性內(nei)切酶(mei)時，每(mei)次(ci)都(dou)要用(yong)新的(de)吸管頭。

2、 限制性內(nei)切酶(mei)壹旦(dan)拿出(chu)冰箱(xiang)後(hou)應當(dang)立即(ji)置於(yu)冰上(shang)。酶(mei)應當(dang)是(shi)最(zui)後(hou)壹個被加(jia)入(ru)到反(fan)應體系中(zhong)（在加(jia)入(ru)酶(mei)之(zhi)前(qian)所(suo)有的(de)其(qi)它(ta)反(fan)應物(wu)都(dou)應當(dang)已經加(jia)好並(bing)已預混合）。

3、 10×bf工作(zuo)濃度(du)為(wei)1×，註意混勻。

4、 酶切時所(suo)加(jia)的(de)DNA溶液體積(ji)不(bu)能(neng)太(tai)大，否(fou)則DNA溶液中(zhong)其(qi)他(ta)成(cheng)分(fen)會幹(gan)擾酶(mei)反(fan)應。

5、 酶通(tong)常保存在50%的(de)甘(gan)油(you)中(zhong)，實驗中(zhong)，應(ying)將(jiang)反(fan)應液(ye)中(zhong)甘(gan)油(you)濃度(du)控制在1/10之下(xia)，否(fou)則(ze)，酶(mei)活性將(jiang)受影(ying)響。

6、 如(ru)果反(fan)應較(jiao)長時間(jian)而酶(mei)切體系又很小比(bi)如(ru)10微升(sheng)，那麽(me)哪怕用(yong)PCR小管做(zuo)反(fan)應，體積(ji)損(sun)失(shi)也(ye)會很大。采用石(shi)蠟(la)油(you)覆(fu)蓋(gai)的(de)方法(fa)可避(bi)免(mian)水分(fen)損(sun)失(shi)甘(gan)油(you)濃度(du)提(ti)高(gao)而(er)引(yin)起(qi)的(de)星(xing)活性。& O; c$ }  H8

7、 混合：這(zhe)是(shi)非常(chang)重(zhong)要然而常(chang)常被忽(hu)略(lve)的(de)壹(yi)步。想(xiang)要(yao)反(fan)應全，必須(xu)使反(fan)應液(ye)充(chong)分(fen)混合。我(wo)們推薦用槍(qiang)反(fan)復吸取混合，或(huo)是(shi)用手指(zhi)輕(qing)彈管壁混合，然後(hou)再快(kuai)速離心(xin)壹(yi)下(xia)即(ji)可。

註意：不(bu)可振(zhen)蕩。

     蘇(su)州(zhou)阿爾(er)生物(wu)14年專註於(yu)生物(wu)反(fan)應器、分(fen)子生物(wu)學實驗設(she)備、實驗室(shi)儀(yi)器、實驗耗(hao)材(cai)、科(ke)研(yan)試(shi)劑(ji)供應，供(gong)應(ying)的(de)儀(yi)器設(she)備包括水浴鍋(guo)、滅(mie)菌鍋(guo)、離(li)心(xin)機(ji)、電泳儀、電泳槽、凝(ning)膠成(cheng)像(xiang)儀(yi)、瑞(rui)寧移液槍(qiang)等(deng)，廣(guang)泛應(ying)用於(yu)分(fen)子生物(wu)學領域(yu)。