質(zhi)粒DNA的提取(qu)實(shi)驗(yan)方法和步驟(zhou)

質(zhi)粒DNA的提取(qu)實(shi)驗(yan)方法和步驟(zhou)

壹(yi)、實(shi)驗(yan)目(mu)的
通過本(ben)實(shi)驗(yan)學習和掌(zhang)握(wo)堿裂解(jie)法提取(qu)質(zhi)粒的原理(li)和步驟(zhou)。
二(er)、實(shi)驗(yan)原理(li)
從細菌(jun)中(zhong)分離(li)質(zhi)粒DNA 的方法都包括(kuo)3個(ge)基(ji)本(ben)步驟(zhou)：培養(yang)細菌(jun)使(shi)質(zhi)粒擴(kuo)增；收集和裂(lie)解(jie)細胞(bao)：分離(li)和純(chun)化(hua)質(zhi)粒DNA。采(cai)用(yong)溶(rong)菌酶(mei)可(ke)以破(po)壞菌(jun)體細胞(bao)壁(bi)，十(shi)二(er)烷基(ji)磺(huang)酸(suan)鈉(na)(SDS)和Triton X-100 可(ke)使細胞(bao)膜(mo)裂(lie)解(jie)。經溶(rong)菌酶(mei)和SDS 或(huo)Triton X-100 處(chu)理(li)後(hou)，細菌(jun)染(ran)色(se)體DNA 會纏(chan)繞(rao)附著(zhe)在細胞(bao)碎(sui)片上(shang)，同時(shi)由於細菌(jun)染(ran)色(se)體DNA 比質(zhi)粒大(da)得多，易(yi)受(shou)機(ji)械(xie)力(li)和核酸酶(mei)等的作用(yong)而被切(qie)斷(duan)成(cheng)不(bu)同大(da)小的線(xian)性(xing)片段(duan)。
堿裂解(jie)法提取(qu)質(zhi)粒是根據共(gong)價閉合(he)環(huan)狀質(zhi)粒DNA與(yu)線(xian)性(xing)染色體DNA在拓(tuo)撲學上(shang)的差異(yi)來(lai)分離(li)它(ta)們。在pH值介於(yu)12.0～12.5這個(ge)狹窄(zhai)的範圍內(nei)，線(xian)性(xing)的DNA雙(shuang)螺(luo)旋(xuan)結(jie)構(gou)解(jie)開而被變(bian)性(xing)，盡管在這(zhe)樣的條件(jian)下，共(gong)價閉環(huan)質(zhi)粒DNA的氫鍵會被斷(duan)裂，但(dan)兩條(tiao)互(hu)補鏈彼(bi)此相互(hu)纏(chan)繞，仍(reng)會緊(jin)密地(di)結(jie)合在壹(yi)起(qi)。當(dang)加(jia)入(ru)pH4.8的乙酸鉀(jia)高(gao)鹽緩沖液恢(hui)復(fu)pH至中(zhong)性時，共(gong)價閉合(he)環(huan)狀的質(zhi)粒DNA的兩條互(hu)補鏈仍(reng)保(bao)持在壹(yi)起(qi)，因(yin)此復(fu)性迅(xun)速(su)而準確，而線(xian)性(xing)的染色體DNA的兩條互(hu)補鏈彼(bi)此已(yi)分開(kai)，復(fu)性就(jiu)不會那(na)木(mu)迅(xun)速(su)而準確，它(ta)們纏(chan)繞形成(cheng)網(wang)狀結構(gou)，通過離(li)心(xin)，染色(se)體DNA與(yu)不(bu)穩定(ding)的大(da)分子(zi)RNA，蛋(dan)白(bai)質(zhi)-SDS復(fu)合物(wu)等壹起(qi)沈澱(dian)下來而被除(chu)去。
質(zhi)粒DNA小(xiao)量提取(qu)法(fa)對於(yu)從大(da)量轉(zhuan)化子(zi)中(zhong)制(zhi)備(bei)少(shao)量(liang)部(bu)分純(chun)化(hua)的質(zhi)粒DNA十(shi)分有(you)用(yong)。這些方法(fa)共(gong)同特點(dian)是簡(jian)便(bian)、快(kuai)速(su)，能同時(shi)處(chu)理(li)大(da)量試樣(yang)，所得(de)DNA有壹(yi)定(ding)純度(du)，可(ke)滿足(zu)限制(zhi)酶(mei)切(qie)割、電泳分析(xi)的需要。
三(san)、主要(yao)試劑
1． 溶(rong)液Ⅰ：50 mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris (pH 8.0) ，10 mmol/L EDTA（pH 8.0）
2． 溶(rong)液Ⅱ：0.2 mol/L NaOH，1% SDS（新鮮配(pei)制(zhi)）
3． 溶(rong)液Ⅲ：5 mol/L乙酸鉀 60 mL，冰(bing)乙酸11.5 mL，水28.5 mL
4. 70%乙(yi)醇
5. 氯(lv)仿(fang): 按(an)氯(lv)仿(fang):異(yi)戊醇＝24:1 體積比加入(ru)異(yi)戊醇。氯(lv)仿(fang)可(ke)使蛋(dan)白(bai)變性並有(you)助(zhu)於(yu)液相與(yu)有(you)機相的分開(kai),異(yi)戊醇則(ze)可(ke)起(qi)消(xiao)除抽(chou)提過程(cheng)中(zhong)出(chu)現(xian)的泡沫。氯(lv)仿(fang)均有(you)很強的腐蝕(shi)性。
6. RNaseA：將(jiang)RNA酶溶(rong)於10 mmol/L Tris. (pH7.5)、15 mmol/L NaCl中(zhong)，配(pei)成(cheng)10 mg／mL的濃(nong)度，於(yu)100℃加(jia)熱(re)15min，緩慢冷卻(que)至室(shi)溫(wen)，保(bao)存於(yu)-20℃。
7. LB+Amp100培養(yang)基(ji)：LB液體培養(yang)基(ji)內(nei)加入(ru)100ug/mL的氨(an)芐青(qing)黴素。註意Amp遇(yu)高(gao)溫(wen)分解(jie)，待培養(yang)基(ji)溫(wen)度低(di)於60℃時(shi)加入(ru)。
四、儀器耗材
恒溫(wen)搖(yao)床、冷凍離(li)心(xin)機、移液槍(qiang)壹套(tao)、制(zhi)冰(bing)機、三(san)角(jiao)瓶、Eppendorf管、試管(guan)、培養(yang)皿(min)、試劑瓶、超凈(jing)工作臺。
五、實(shi)驗(yan)步驟(zhou)
1. 從平板(ban)上(shang)挑取(qu)單(dan)克(ke)隆，加(jia)入(ru)含有3mL LB+Amp100的試管(guan)中，37℃振蕩培養(yang)過夜(ye)。
2. 取(qu)培養(yang)物倒入(ru)1.5 mL微量離(li)心(xin)管中(zhong)，4000 r/min 離心(xin)2 min。
註：剩(sheng)余(yu)培養(yang)物放(fang)置4℃，用(yong)於保(bao)菌。
3. 倒出培養(yang)液，使細胞(bao)沈澱(dian)盡可(ke)能幹(gan)燥。
4. 將(jiang)細菌(jun)沈澱(dian)懸浮(fu)於(yu)100 μL溶(rong)液Ⅰ中，充(chong)分振蕩混(hun)勻，室(shi)溫(wen)放(fang)置5 min。
5. 加200 μL溶(rong)液 Ⅱ（新鮮配(pei)制(zhi)），蓋(gai)緊(jin)管(guan)口，顛(dian)倒混(hun)勻內(nei)容物，將(jiang)離心(xin)管放(fang)冰(bing)上(shang)5 min 。
6. 加(jia)入(ru)150 μL溶(rong)液 Ⅲ（冰(bing)上(shang)預冷），蓋(gai)緊管(guan)口，顛(dian)倒數次(ci)使(shi)混(hun)勻。冰(bing)上(shang)放(fang)置5 min。
7. 12000 r/min ，離心(xin)15 min ，將(jiang)上(shang)清轉至另壹(yi)離(li)心(xin)管中(zhong)。350μL
8. 向(xiang)上(shang)清中加入(ru)等體積氯仿(fang)/異(yi)戊醇（24:1）（去蛋(dan)白(bai)），反復(fu)混(hun)勻，10000 r/min，離(li)心(xin)10 min，將(jiang)上(shang)清轉移到另(ling)壹(yi)離心(xin)管中(zhong)。該步驟(zhou)可(ke)以不(bu)做。
9. 向(xiang)上(shang)清加入(ru)2倍體積乙醇700μL，混(hun)勻後(hou)，室溫(wen)放(fang)置15-30min。10000r/min離心(xin)10 min。倒去上(shang)清液，把(ba)離(li)心(xin)管倒扣在吸(xi)水紙(zhi)上(shang)，吸(xi)幹液體。
10. 用(yong)500 μL 70% 乙醇輕(qing)輕洗(xi)滌(di)質(zhi)粒DNA沈澱(dian)，離心(xin)10000r/min離心(xin)5min棄上(shang)清，幹燥。
11. 加入(ru)適量（20-50 μL）的無菌水，室(shi)溫(wen)使DNA溶(rong)解(jie)，-20℃保(bao)存。
六、註意事(shi)項
1. 溶(rong)液II需要新鮮配(pei)制(zhi)。
2. 加(jia)入(ru)溶(rong)液II後不能劇烈震蕩。
3. 沈澱(dian)DNA 通常(chang)使用(yong)冰(bing)乙醇，在低(di)溫(wen)條件(jian)下放(fang)置時間稍(shao)長(chang)可(ke)使DNA 沈澱(dian)。沈澱(dian)DNA 也可(ke)用(yong)異(yi)丙(bing)醇(壹(yi)般使用(yong)等體積)，且(qie)沈澱(dian)，速(su)度快(kuai)，但(dan)常(chang)把(ba)鹽沈澱(dian)下來，所以(yi)多數還(hai)是用(yong)乙醇。
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