PCR反應(ying)的(de)基(ji)本原(yuan)理與(yu)實(shi)驗技(ji)術(shu)

壹、實(shi)驗目(mu)的(de)： 掌(zhang)握(wo)PCR反(fan)應(ying)的(de)基(ji)本原(yuan)理與(yu)實(shi)驗技(ji)術(shu)

二、PCR反(fan)應(ying)實驗原(yuan)理
   PCR( Polymerase Chain Reaction)-聚(ju)合酶鏈(lian)式反應(ying)，可以(yi)選擇(ze)性(xing)擴(kuo)增壹段(duan)DNA序列。其(qi)基(ji)本步驟是，首(shou)先將(jiang)待(dai)擴(kuo)增的(de)模板DNA變性(xing)使(shi)之(zhi)成為(wei)單(dan)鏈(lian)，DNA樣(yang)品中(zhong)，特異性(xing)的(de)引(yin)物(wu)能(neng)夠(gou)與(yu)其(qi)互補(bu)的(de)序列雜交，在dNTPs和Taq酶存(cun)在時，就可以(yi)合成模板DNA的(de)互(hu)補(bu)鏈(lian)，反應(ying)完(wan)成後，將(jiang)反應(ying)混(hun)合物(wu)加(jia)熱使DNA雙鏈(lian)變性(xing)，溫度(du)下(xia)降(jiang)後，過量的(de)引(yin)物(wu)又(you)可以(yi)開(kai)始(shi)第二輪(lun)的(de)合成反應(ying)。這(zhe)種(zhong)延伸-變性(xing)-退火-延伸的(de)循(xun)環可以(yi)重(zhong)復(fu)多(duo)次(ci)，使(shi)所(suo)需(xu)要的(de)DNA片(pian)段得(de)到特異性(xing)的(de)擴(kuo)增。
1. 變性(xing)：加(jia)熱使模板DNA在高溫下(xia)（94℃）變性(xing)，雙鏈(lian)間的(de)氫(qing)鍵斷裂而形成兩條單(dan)鏈(lian).
2. 退火：使(shi)溶(rong)液溫度(du)降(jiang)至50～60℃，模板DNA與(yu)引物(wu)按堿基(ji)配對(dui)原(yuan)則(ze)互(hu)補(bu)結合.
3. 延伸：溶液反(fan)應(ying)溫度(du)升(sheng)至72℃，耐(nai)熱DNA聚合酶以(yi)單(dan)鏈(lian)DNA為(wei)模板，在引物(wu)的(de)引(yin)導(dao)下(xia)，利用反應(ying)混(hun)合物(wu)中(zhong)的(de)4種(zhong)脫(tuo)氧(yang)核(he)苷三磷(lin)酸（dNTPs），按5ˊ→3ˊ方向復制出(chu)互(hu)補(bu)DNA。
   上(shang)述3步為(wei)壹個(ge)循環，即高(gao)溫變性(xing)、低(di)溫退火、中(zhong)溫延伸3個階段(duan)。從(cong)理論(lun)上(shang)講(jiang)，每經(jing)過壹個(ge)循環，樣(yang)本中(zhong)的(de)DNA量應(ying)該增加(jia)壹倍，新(xin)形(xing)成的(de)鏈(lian)又可成為(wei)新壹輪(lun)循(xun)環的(de)模板，經(jing)過25～30個(ge)循(xun)環後DNA可擴(kuo)增10⁶～10⁹倍。
    典(dian)型(xing)的(de)PCR反(fan)應(ying)體(ti)系(xi)由如(ru)下組分組成：DNA模板、反(fan)應(ying)緩沖液、dNTPs、MgCl₂、兩個合成的(de)DNA引(yin)物(wu)、耐(nai)熱Taq聚合酶。
三、 試劑(ji)和緩沖液
PCR mix，10×PCR Buffer，引(yin)物(wu)，模板。
四(si)、 儀器耗材(cai)
PCR儀，掌上(shang)離心機，微(wei)量移(yi)液器，槍頭(tou)，1.5mL離心管，PCR管，冰盒(he)。
五、 實(shi)驗步驟（每人壹組，每人做(zuo)1管，純(chun)化時兩人壹組）
1. 查找(zhao)基(ji)因序列，設計(ji)合成PCR引物(wu)。註(zhu)意(yi)合成引物(wu)約(yue)需(xu)壹周時間(jian)，請提前準備。詳細(xi)步驟請參(can)考(kao)實(shi)驗壹後面(mian)的(de)附(fu)件(jian)內容。
2. 在50μL反應(ying)體(ti)系(xi)中(zhong)，加(jia)入：
　　　　模板DNA (5ng/μL)        1   
　　　　引(yin)物(wu)P₁P₂ (10μmol/L)    各(ge)1   
　　　　2×PCR mix              25 
　　　　ddH₂O                  22 
在冰上(shang)配(pei)制，註(zhu)意(yi)混(hun)勻(yun)後離心。加(jia)入10μL石(shi)蠟油覆蓋。
3. 在PCR儀中(zhong)預(yu)變性(xing)94℃ 4min，然後循環：94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 60s，30個循(xun)環；循環結束後，72℃10min 。擴(kuo)增的(de)PCR產物(wu)4℃保(bao)存(cun)。（OC-II）
4. 取PCR產物(wu)2-5μL與(yu)上(shang)樣(yang)緩沖液混(hun)合，點樣(yang)。
5. 1% 瓊(qiong)脂(zhi)糖膠電泳(yong)，160V 30-40min。
　　6. 電泳(yong)結(jie)束，溴(xiu)化乙錠染色5-10分(fen)鐘(zhong)。
7. 用凝(ning)膠成像(xiang)儀觀察、拍(pai)照(zhao)。
8. PCR產物(wu)切(qie)膠回(hui)收(shou)。步驟參(can)見膠回(hui)收(shou)Kit說(shuo)明(ming)書。
A 酶切(qie)片(pian)段的(de)純(chun)化及(ji)其(qi)回收(shou)
使(shi)用(yong)切(qie)膠回(hui)收(shou)kit進(jin)行(xing)PCR產物(wu)的(de)回(hui)收(shou)。具(ju)體(ti)操(cao)作(zuo)步驟如(ru)下，詳(xiang)見說(shuo)明(ming)書。
1）稱(cheng)回(hui)收(shou)的(de)膠，每0.1g加(jia)100µL XP2 ；
2）55度(du)5-7分(fen)鐘(zhong)至溶膠 ；
3）取溶(rong)膠液加(jia)入回(hui)收(shou)柱(zhu)子，最(zui)大(da)體(ti)積(ji)700µL；10000g, 1min；
4) 加(jia)300µl XP2 ，10000g 1min；
5）加(jia)700µl SPW ，10000g 1min；
6）重復(fu)5）；
7）空管離心2min，13000 g
8）幹燥，加(jia)15-30µL  Eulation Buffer
9）13000 g，1min
 
DNA產物(wu)純(chun)化kit，操作步驟：

• 將(jiang)PCR反應(ying)液（40ul）或(huo)酶促反(fan)應(ying)液移(yi)至壹幹凈(jing)的(de)1.5ml離心管中(zhong)，加(jia)入5倍體(ti)積(ji)的(de)buffer3，充(chong)分(fen)混(hun)勻(yun)。（用前(qian)確定(ding)加(jia)入適量的(de)異丙(bing)醇(chun)）

• 將(jiang)混(hun)合液全(quan)部移入吸附柱(zhu)，8000g離心30s；將(jiang)濾出(chu)液再(zai)次(ci)加(jia)入到(dao)吸附柱(zhu)中(zhong)再(zai)次(ci)過柱(zhu)，8000g離心30s（此步驟可以(yi)提(ti)高(gao)回(hui)收(shou)效(xiao)率）；倒(dao)掉收(shou)集(ji)管中(zhong)的(de)液體(ti)，將(jiang)吸附柱(zhu)放(fang)入(ru)同(tong)壹收(shou)集(ji)管中(zhong)。

• 向吸附柱(zhu)中(zhong)加(jia)入500ul Wash Solution（加(jia)到壁(bi)上(shang)），9000g離心30s。倒(dao)掉收(shou)集(ji)管中(zhong)的(de)液體(ti)，將(jiang)吸附柱(zhu)放(fang)入(ru)同(tong)壹收(shou)集(ji)管中(zhong)。（Wash Solution使(shi)用(yong)前(qian)請(qing)檢查是否(fou)已(yi)加(jia)入正(zheng)確量的(de)無水乙醇(chun)）

• 重(zhong)復(fu)步驟3壹次(ci)

• 將(jiang)空吸附柱(zhu)和收(shou)集(ji)管放(fang)入(ru)離心機，9000g離心1min。下(xia)管扔掉，上(shang)管放(fang)入(ru)1.5ml離心管中(zhong)，晾(liang)幹。（殘余(yu)的(de)乙(yi)醇(chun)會(hui)嚴(yan)重影(ying)響(xiang)得(de)率和後續(xu)試驗）

• 在吸附膜(mo)中(zhong)央(yang)加(jia)入25ul 60℃提(ti)前預(yu)熱（進壹步提高得(de)率）的(de)Elution Buffer（加(jia)到濾(lv)芯上(shang)），室溫靜置(zhi)1min，9000g離心1min。將(jiang)所(suo)得(de)到的(de)DNA溶(rong)液置(zhi)於-20℃保(bao)存(cun)或(huo)用(yong)於後續(xu)試驗。

註(zhu)意：本(ben)步驟中(zhong)，所(suo)有(you)轉速(su)單(dan)位為(wei)g。

B 乙醇(chun)沈(chen)澱(dian)法
也(ye)可以(yi)使(shi)用(yong)乙(yi)醇(chun)沈(chen)澱(dian)法對(dui)PCR產物(wu)回(hui)收(shou)。具(ju)體(ti)操(cao)作(zuo)步驟如(ru)下。

• 加(jia)入等(deng)體(ti)積(ji)的(de)冰(bing)無水乙醇(chun)，加(jia)入1/10體(ti)積(ji)的(de)KAc（3M  pH5.2）。

• 上(shang)下(xia)顛(dian)倒(dao)混(hun)勻(yun)，-20℃30min；12000r/min 4℃ 10min。

• 棄上(shang)清(qing)，加(jia)入70%的(de)冰(bing)乙(yi)醇(chun)，輕(qing)輕(qing)混(hun)勻(yun)。12000r/min 4℃離心10min。

• 棄(qi)上(shang)清(qing)，室溫幹燥，至無乙醇(chun)。

• 加(jia)入適量體(ti)積(ji)的(de)ddH2O。

六(liu)、註意(yi)事(shi)項(xiang)

1. 進(jin)行(xing)PCR反應(ying)時，註(zhu)意加(jia)入試劑(ji)的(de)順(shun)序。註意加(jia)入任何壹種(zhong)試劑(ji)後均需(xu)混(hun)勻(yun)。
2. 本實(shi)驗使(shi)用2xPCR mix，包(bao)含(han)有dNTPs和Taq酶。
3. 引(yin)物(wu)的(de)稀(xi)釋(shi)：分(fen)子(zi)量24bp*324.5 = 7788，質(zhi)量數(shu)10OD*33 ＝33ug，摩爾(er)數=33/7788 =4.2 nmol，母(mu)液濃(nong)度(du)4.2 n mol / 84μL H₂O = 50μmol/L，使(shi)用(yong)時取母(mu)液稀(xi)釋(shi)5倍，則(ze)終(zhong)濃度(du)為(wei)10μmol/L。
4. PCR擴(kuo)增產物(wu)共(gong)20μL，其(qi)中(zhong)2-5 μL用(yong)於檢測，剩余(yu)的(de)用(yong)於純(chun)化回收(shou)。
5. 使(shi)用(yong)自(zi)己(ji)的(de)實(shi)驗材(cai)料(liao)進行PCR擴(kuo)增的(de)學(xue)生(sheng)，請提前(qian)準備引物(wu)和模板。

 

附(fu)1：基(ji)因序列查找(zhao)和PCR引物(wu)設(she)計(ji)

實(shi)驗課(ke)進行(xing)之(zhi)前(qian)，需(xu)要利(li)用(yong)NCBI查找(zhao)基(ji)因序列，並(bing)設計(ji)PCR引(yin)物(wu)。

• 進(jin)入(ru)NCBI（後，在Search的(de)下(xia)拉(la)框中(zhong)選擇(ze)Nucleotide，再(zai)輸入基(ji)因名稱，點擊(ji)Search即(ji)可。也可輸入具體(ti)的(de)物(wu)種(zhong)名以(yi)縮(suo)小範(fan)圍，獲(huo)得(de)cDNA 序列信(xin)息(xi)。

例如(ru)：水稻(dao)半胱(guang)氨酸蛋白(bai)酶抑制劑(ji)基(ji)因（Oryzacystatin, OC）序列信(xin)息(xi)
OC-II, Os05g41460, 456bp
ATGCGGGCATCATCTCTCTTCGCGGAATCGGTGTTCACTACATCTGCTGCTGCTGGTCGTCGTCGTTGTCCTCGTCTCGCCGCCGTTCCCGTTACCCTCTTCTTCTCCACCGGTCGCGGCTCGCCGGCGATGGCCGAGGAGGCGCAGCAGCCACGCGGCGTGAAGGTGGGCGGCATCCACGACGCGCCGGCCGGGCGCGAGAACGACCTCACCACCGTCGAGCTCGCCCGGTTCGCCGTCGCCGAGCACAACAGCAAGGCCAACGCGATGTTGGAGTTGGAGAGGGTGGTGAAGGTGAGGCAGCAGGTGGTGGGCGGGTTCATGCACTACCTCACCGTCGAGGTGAAGGAACCCGGCGGCGCCAATAAGCTGTACGAGGCCAAGGTGTGGGAGAGGGCGTGGGAGAACTTCAAGCAGCTCCAGGATTTCAAGCCCCTCGACGACGCCACCGCCTAA

• 引(yin)物(wu)設(she)計(ji)。要(yao)求(qiu)擴(kuo)增上(shang)述完(wan)整(zheng)的(de)cDNA 序列，並(bing)在兩端添(tian)加(jia)酶切(qie)位點(dian)，5‘添(tian)加(jia)EcoRI（GAATTC）， 3‘端添(tian)加(jia)HindIII （AAGCTT）。以(yi)便(bian)克(ke)隆(long)到pET30a的(de)相(xiang)應(ying)位點(dian)。

註(zhu)意PCR產物(wu)中(zhong)沒有(you)上(shang)述酶切(qie)位點(dian)，否(fou)則不能(neng)使(shi)用(yong)。
prim-OC2-R   GCAAGCTTTTAGGCGGTGGCGTCGTC    26bp  下(xia)劃線為(wei)EcoRI識(shi)別序列
#prim-OC2-F   GCGAATTCATGCGGGCATCATCTCTC    26bp  下劃線為(wei)HindIII 識(shi)別序列
 
T載體(ti)通用引(yin)物(wu)
B0012 (M13-47) CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC
B0014 (M13-48) AGCGGATAACAATTTCACACAGGA