瓊(qiong)脂(zhi)糖凝膠電(dian)泳檢(jian)測(ce)DNA的方法

壹(yi)、實(shi)驗目(mu)的：通過(guo)本實(shi)驗學(xue)習(xi)瓊(qiong)脂(zhi)糖凝膠電(dian)泳檢(jian)測(ce)DNA的方法和技(ji)術(shu)。
二、實(shi)驗原(yuan)理
DNA分子在(zai)瓊(qiong)脂(zhi)糖凝膠中(zhong)泳動時(shi)有(you)電(dian)荷效(xiao)應和分子篩(shai)效應。DNA分子在(zai)高(gao)於等電(dian)點的pH溶(rong)液(ye)中(zhong)帶負電(dian)荷在(zai)電(dian)場中(zhong)向(xiang)正極移(yi)動。由於糖－磷酸(suan)骨架在結(jie)構上(shang)的重(zhong)復性質(zhi)，相同(tong)數(shu)量(liang)的雙鏈(lian)DNA幾乎具(ju)有(you)等量(liang)的凈電(dian)荷，因(yin)此他(ta)們能以相同(tong)的速(su)度(du)向(xiang)正極方(fang)向(xiang)移(yi)動。在壹定(ding)的電(dian)場強(qiang)度(du)下，DNA分子的遷移速(su)度(du)取決(jue)於分子篩(shai)效應，即DNA分子本身的大小(xiao)和構(gou)型。具(ju)有(you)不同(tong)的相對(dui)分子質(zhi)量的DNA片段泳(yong)動(dong)速(su)度(du)不壹(yi)樣(yang)，可進行分離(li)。DNA分子的遷移速(su)度(du)與相對(dui)分子質(zhi)量對(dui)數(shu)值(zhi)成反(fan)比關(guan)系(xi)。凝膠(jiao)電(dian)泳不僅(jin)可(ke)以分離(li)不同(tong)相對(dui)分子質(zhi)量的DNA， 也可以(yi)分離(li)相對(dui)分子質(zhi)量相同(tong)，但(dan)構型不同(tong)的DNA分子。如(ru)質(zhi)粒有(you)3種(zhong)構型：超(chao)螺旋(xuan)的共價閉合環(huan)狀(zhuang)質(zhi)粒DNA(covalently closed circμLar DNA，簡(jian)稱 CCCDNA)；開環(huan)質(zhi)粒DNA，即共價(jia)閉合環(huan)狀(zhuang)質(zhi)粒DNA 1條(tiao)鏈斷(duan)裂，（open circμLar DNA， 簡(jian)稱OCDNA）；線狀(zhuang)質(zhi)粒DNA ，即共價(jia)閉合環(huan)狀(zhuang)質(zhi)粒DNA 2條(tiao)鏈發(fa)生(sheng)斷裂，（linear DNA，簡(jian)稱L DNA）。這3種(zhong)構型的質(zhi)粒DNA分子在(zai)凝膠(jiao)電(dian)泳中(zhong)的遷移率(lv)不同(tong)。因(yin)此電(dian)泳後呈3條帶，超(chao)螺旋(xuan)質(zhi)粒DNA泳(yong)動最快，其次(ci)為(wei)線(xian)狀(zhuang)DNA和開(kai)環(huan)質(zhi)粒DNA。
三(san)、主要(yao)試劑(ji)
瓊(qiong)脂(zhi)糖、溴酚(fen)藍、TE、TAE、EB、DNA marker.
1. 10 x TAE (10倍體積(ji)的TAE儲(chu)存液)
 配 1000mL 50 ×TAE：Tris 242g，冰乙酸(suan)57.1mL，0.5 mol/L EDTA 100 mL pH8.0
    2. 凝(ning)膠加(jia)樣緩(huan)沖(chong)液(ye)（6×）：溴酚(fen)藍0.25％，蔗糖40％
    3. 瓊(qiong)脂(zhi)糖（1%）：稱1g瓊(qiong)脂(zhi)糖，放入(ru)250 mL三角瓶(ping)內，加(jia)入(ru)100 mL 1×TAE電(dian)泳緩(huan)沖液(ye)，加(jia)熱(re)煮(zhu)沸(fei)等其冷至(zhi)60℃左(zuo)右(you)，倒(dao)入(ru)封好(hao)的電(dian)泳板上。
    4. 溴化(hua)乙錠溶(rong)液(ye) (EB) 0.5 μg /mL，置(zhi)棕(zong)色(se)瓶避(bi)光保存。
四(si)、儀(yi)器(qi)耗(hao)材
電(dian)泳儀(yi)、電(dian)泳槽(cao)、凝膠(jiao)成像儀(yi)、移(yi)液槍(qiang)壹套(tao)、微波(bo)爐(lu)。
五(wu)、實(shi)驗步(bu)驟(zhou)
1. 制備瓊(qiong)脂(zhi)糖凝膠：稱取0.1g瓊(qiong)脂(zhi)糖，放入(ru)錐形瓶(ping)中(zhong)，加(jia)入(ru)10mL 1×TAE緩沖(chong)液，至(zhi)微波(bo)爐(lu)加(jia)熱(re)至(zhi)溶(rong)化(hua)，取出(chu)搖勻(yun)，則為(wei)1％的瓊(qiong)脂(zhi)糖凝膠液(ye)。
2. 膠(jiao)板的制備：取有(you)機(ji)玻璃內槽(cao)，洗(xi)凈晾(liang)幹(gan)。將有(you)機(ji)玻璃內槽(cao)放置(zhi)於壹水(shui)平(ping)位置(zhi)，並放好(hao)樣(yang)品梳子(zi)。
3. 將冷到(dao)60℃左(zuo)右(you)的瓊(qiong)脂(zhi)糖凝膠液(ye)，緩(huan)緩(huan)倒(dao)入(ru)有(you)機(ji)玻璃內槽(cao)，直至(zhi)有(you)機(ji)玻璃板上形成壹層均(jun)勻(yun)的膠面(mian)（註(zhu)意不要(yao)形成氣泡(pao)）。待(dai)膠(jiao)凝(ning)固後，取出梳子(zi)，放在電(dian)泳槽(cao)內。加(jia)入(ru)電(dian)泳緩(huan)沖液(ye)至(zhi)電(dian)泳槽(cao)中(zhong)。
4. 加(jia)樣：將樣品5μL與(yu)上(shang)樣緩(huan)沖液1μL混合(he)，用(yong)移液(ye)槍(qiang)將該混合(he)樣(yang)品加(jia)入(ru)樣品(pin)孔（記(ji)錄(lu)點樣順(shun)序(xu)及點(dian)樣(yang)量）。同(tong)時(shi)加(jia)入(ru)DNA marker作為(wei)對(dui)照。
5. 電(dian)泳：接(jie)通電(dian)泳槽(cao)與電(dian)泳儀(yi)的電(dian)源(yuan)（註(zhu)意正負極，DNA片段從(cong)負極向(xiang)正極移(yi)動）。DNA的遷移速(su)度(du)與電(dian)壓(ya)成正比，最高(gao)電(dian)壓(ya)不超(chao)過(guo)5 V/cm。 當溴酚(fen)藍染料移動到(dao)距(ju)凝(ning)膠前沿1～2cm處(chu)，停(ting)止電(dian)泳。
6. 染(ran)色(se)：將電(dian)泳後的凝膠浸(jin)入(ru)溴化(hua)乙錠染(ran)色(se)液（0.5mg/mL）中(zhong)，染色(se)10min（戴手套(tao)操(cao)作(zuo)）。
7. 觀察：在(zai)紫(zi)外燈下觀察凝(ning)膠中(zhong)的條帶（戴(dai)手(shou)套操(cao)作(zuo)），並記錄(lu)拍(pai)照。
8. 有(you)EB的凝膠要(yao)放到(dao)專用的垃(la)圾(ji)袋中(zhong)作專門(men)處理，以免(mian)汙(wu)染環境(jing)（戴手(shou)套(tao)操(cao)作(zuo)）。
六(liu)、註(zhu)意事(shi)項(xiang)
1．EB是強(qiang)誘(you)變劑(ji)並有(you)中(zhong)等毒性，配制(zhi)和使(shi)用(yong)時(shi)都(dou)應戴手套，並且不要(yao)把EB灑到(dao)桌面(mian)或地(di)面(mian)上。凡(fan)是沾汙了(le)EB的容器或(huo)物(wu)品必(bi)須(xu)經(jing)專(zhuan)門(men)處理後才能清洗(xi)或丟棄。
2．當EB太多，膠染色(se)過(guo)深，DNA帶看(kan)不清時(shi)，可(ke)將膠放入(ru)蒸餾水(shui)沖泡(pao)後再(zai)觀察。
3．電(dian)泳時(shi)註(zhu)意導線正負極，防止接(jie)反(fan)。
蘇(su)州阿(e)爾法生(sheng)物(wu)實(shi)驗器(qi)材(cai)有(you)限公司14年(nian)專註(zhu)於凝膠電(dian)泳設(she)備，生(sheng)物(wu)實(shi)驗室儀(yi)器(qi)設(she)備和生(sheng)物(wu)試劑(ji)、PCR耗(hao)材、細胞培養(yang)耗(hao)材供應。