使用微載(zai)體(ti)生物(wu)反(fan)應器(qi)規(gui)模(mo)化擴(kuo)增 Vero 細(xi)胞的方法(fa)

      絕大(da)多(duo)數(shu)貼(tie)壁(bi) Vero 細胞(bao)擴(kuo)增培(pei)養都是使用微載(zai)體(ti)技(ji)術(shu)在攪(jiao)拌式(shi)細胞(bao)生物(wu)反(fan)應器(qi)中(zhong)進行(xing)的。在(zai)這裏(li)，細胞(bao)附著在(zai)微載(zai)體(ti)上(shang)，微載(zai)體(ti)被設計(ji)成(cheng)在(zai)攪拌培養(yang)中(zhong)保(bao)持(chi)懸(xuan)浮。
微載(zai)體(ti)的種類很多(duo)，主(zhu)要分為(wei)固(gu)體(ti)和(he)大(da)孔兩種，表(biao)面(mian)性(xing)質不同。幾(ji)項(xiang)研究(jiu)比較(jiao)了(le)不同類型的微載(zai)體(ti)用於(yu) Vero 細胞(bao)的繁(fan)殖(zhi). 目(mu)前多(duo)數(shu)使用Cytodex 1 微載(zai)體(ti) . Cytodex 1 微載(zai)體(ti)是(shi)基(ji)於(yu)葡(pu)聚糖(tang)的固(gu)體(ti)微載(zai)體(ti)，顯(xian)示(shi)帶(dai)電(dian)表(biao)面(mian)，平均(jun)直徑(jing)為(wei) 180 μm左右(you)。 近(jin)年(nian)來(lai)，國內(nei)生產(chan)的DISKS片狀載(zai)體(ti)孔(kong)徑(jing)只(zhi)有(you)15μm，單層厚度(du)約(yue)0.44mm,可以維持(chi)較(jiao)好(hao)的營養物(wu)質交(jiao)換(huan)環境(jing)，並且(qie)減(jian)少(shao)細胞(bao)代(dai)謝有(you)害物(wu)質的積累，較(jiao)適(shi)宜哺乳動(dong)物(wu)貼(tie)壁(bi)細胞(bao)的生長(chang)。
        微載(zai)體(ti)培(pei)養(yang)可(ke)以(yi)在不銹(xiu)鋼微載(zai)體(ti)培(pei)養(yang)生物(wu)反(fan)應器(qi)中(zhong)進行(xing)。使用生物(wu)反(fan)應器(qi)的優(you)勢(shi)之(zhi)在(zai)於(yu)其工藝(yi)參(can)數(shu)可(ke)以(yi)放大(da)到(dao)更大(da)尺寸的生物(wu)反(fan)應器(qi)。生產(chan)階(jie)段(duan)通(tong)過(guo)使用更大(da)體(ti)積的發(fa)酵(jiao)罐連續(xu)培養可以(yi)降(jiang)低運營成(cheng)本(ben)。此(ci)外(wai)，生物(wu)反(fan)應器(qi)用於(yu)動(dong)物(wu)細(xi)胞培養的用途已(yi)經建立(li)，具有許多(duo)不同的配(pei)置(zhi)，適用於(yu)大(da)規(gui)模(mo)操作(zuo)。
此外(wai)，細(xi)胞(bao)生物(wu)反(fan)應器(qi)提(ti)供(gong)了(le)應用廣(guang)泛(fan)的過(guo)程(cheng)分析技(ji)術(shu)和(he)過(guo)程(cheng)控(kong)制(zhi)策(ce)略(lve)的選(xuan)擇。壹個關(guan)鍵點是(shi)，以(yi)恒定速率(lv)控(kong)制(zhi)混(hun)合可使培養物(wu)保(bao)持(chi)均(jun)勻(yun)。細(xi)胞(bao)、營養物(wu)和(he)溶解(jie)氣體(ti)分布(bu)均(jun)勻(yun)，較(jiao)大(da)程(cheng)度(du)地(di)減少(shao)了(le)組(zu)件的局部限制(zhi)，並且(qie)可(ke)以(yi)準確(que)、實(shi)時地(di)測量整(zheng)個過(guo)程(cheng)參(can)數(shu)（例(li)如溫度(du)、pH 值、溶解(jie)氧）。除(chu)了(le)對(dui)培(pei)養(yang)物(wu)進行(xing)在線(xian)監測外(wai)，生物(wu)反(fan)應器(qi)甚(shen)至還(hai)可(ke)以(yi)在(zai)不幹(gan)擾培養(yang)物(wu)的情況下對(dui)小體(ti)積樣(yang)品(pin)進行(xing)離(li)線(xian)分析（例(li)如細胞(bao)計(ji)數、代(dai)謝物(wu)濃度(du)、葡(pu)萄糖(tang)乳酸(suan)測(ce)定等）。
在(zai)大(da)規(gui)模(mo)細胞(bao)擴(kuo)增的情況下，攪(jiao)拌槳的剪(jian)切力(li)、攪拌速率(lv)都會(hui)對細(xi)胞得(de)生長(chang)產生影(ying)響。壹般來說，攪拌速率(lv)需(xu)要足(zu)夠高以保(bao)持(chi)微載(zai)體(ti)懸(xuan)浮在(zai)培(pei)養(yang)物(wu)中(zhong)並確(que)保(bao)均(jun)勻(yun)混(hun)合以及(ji)充(chong)分的氣(qi)體(ti)轉(zhuan)移(yi). 同時(shi)，攪(jiao)拌也應保(bao)持(chi)在(zai)低限速(su)，因(yin)為(wei)過(guo)高的攪(jiao)拌速率(lv)會(hui)因(yin)剪(jian)切應力(li)而(er)顯(xian)著損(sun)害細胞(bao)生長(chang)。
貼(tie)壁(bi)過(guo)程(cheng)中(zhong)的細(xi)胞(bao)密(mi)度(du)受表(biao)面(mian)積的限制(zhi)，而(er)表(biao)面(mian)積由(you)微載(zai)體(ti)的總數(shu)決(jue)定。已經研究了(le)不同濃度(du)的 Cytodex 1 微載(zai)體(ti)的使用，濃度(du)範(fan)圍為(wei) 1.5 至 10 g/L。壹方面，較(jiao)高的微載(zai)體(ti)濃度(du)始(shi)終會(hui)導(dao)致較(jiao)高的細(xi)胞(bao)密(mi)度(du)，但(dan)另(ling)壹方面會(hui)出現氧氣和(he)營養限制(zhi)等(deng)技(ji)術(shu)挑(tiao)戰(zhan). 例(li)如，在(zai)批(pi)處理(li)模(mo)式(shi)下， 在(zai)微載(zai)體(ti)濃度(du)為(wei) 2、3 和(he) 6 g/L 時，Cytodex 1 的細(xi)胞(bao)密(mi)度(du)分別(bie)達到(dao) 2.1 × 10 ⁶、2.6 × 10 ⁶和(he) 3.6 × 10 ⁶ 個細胞(bao)/mL 。
相(xiang)比之下，灌註(zhu)培養(yang)模(mo)式(shi)具有更高的細(xi)胞(bao)密(mi)度(du)。在(zai)灌註(zhu)過(guo)程(cheng)中(zhong)，因(yin)不斷向(xiang)培養物(wu)中(zhong)加(jia)入(ru)新(xin)鮮培(pei)養(yang)基(ji)，並以(yi)相(xiang)同的速(su)度(du)去除(chu)用過(guo)的培(pei)養(yang)基(ji)，這樣(yang)可以長(chang)時間(jian)維持(chi)足(zu)夠的底物(wu)水(shui)平以減(jian)少和(he)抑制(zhi)副(fu)產(chan)物(wu)的形(xing)成(cheng)。 據報(bao)道(dao)，使用灌註(zhu)培養(yang)法(fa)在微載(zai)體(ti)濃度(du)為(wei) 2、3 和(he) 10 g/L 時，Cytodex 1 的細(xi)胞(bao)密(mi)度(du)分別(bie)為(wei) 2.1 × 10 ⁶、4.7 × 10 ⁶和(he) 7.8 × 10 ⁶細胞(bao)/mL。通(tong)過(guo)再(zai)循環模(mo)式(shi)下，細(xi)胞密(mi)度(du)甚(shen)至可以達到(dao) 5.5 × 10 ⁶和(he) 10.1 × 10 ⁶ 。


為(wei)細胞(bao)提(ti)供(gong)適(shi)量的營養是(shi)壹項復雜(za)的任(ren)務，尤其(qi)是(shi)在高細胞(bao)密(mi)度(du)的情況下。為(wei)降低汙(wu)染風(feng)險(xian)，Vero 細(xi)胞擴(kuo)增培(pei)養壹般使用無血(xue)清(qing)的培(pei)養(yang)基(ji)。 另(ling)外(wai)，Vero 細(xi)胞(bao)培(pei)養物(wu)中(zhong)的主(zhu)要代(dai)謝物(wu)是(shi)葡(pu)萄糖(tang)、谷氨(an)酰胺(an)、谷氨(an)酸(suan)、乳酸(suan)和(he)氨。這些(xie)代(dai)謝產(chan)物(wu)在(zai)細胞擴(kuo)增培(pei)養過(guo)程(cheng)的中(zhong)後(hou)期會(hui)嚴(yan)重(zhong)影響到(dao)細(xi)胞生長(chang)。分析培(pei)養基(ji)的成(cheng)分消(xiao)耗和(he)代(dai)謝產(chan)物(wu)乳酸(suan)的濃度(du)，有(you)助於(yu)及(ji)時根據細胞(bao)生長(chang)狀態(tai)調(tiao)整(zheng)培養(yang)環境(jing)參數(shu)，評估不同規(gui)模(mo)、不同培(pei)養(yang)模(mo)式(shi)、不同培(pei)養(yang)策(ce)略(lve)或不同生物(wu)反(fan)應器(qi)系(xi)統(tong)之間(jian)的差異。例如(ru)：德國Biosen C-Line 乳酸(suan)分析儀(yi)可以(yi)在(zai)線(xian)實時分析培(pei)養物(wu)的乳酸(suan)濃度(du)。
    蘇(su)州阿(e)爾法(fa)實驗器材(cai)有限公(gong)司(si)提供(gong)3L/5L/7.5L/15L/40L//50L/75L/150L/200L/500L/2000L等(deng)多(duo)種規(gui)格(ge)的不銹(xiu)鋼生物(wu)反(fan)應器(qi)、微載(zai)體(ti)生物(wu)反(fan)應器(qi)、籃式(shi)生物(wu)反(fan)應器(qi)、細(xi)胞生物(wu)反(fan)應器(qi)、微生物(wu)發(fa)酵(jiao)罐等(deng)，同時(shi)提(ti)供(gong)的德國EKF Biosen C-Line 乳酸(suan)分析儀(yi)可用於(yu)生物(wu)反(fan)應器(qi)內(nei)的葡(pu)萄糖(tang)、乳酸(suan)測(ce)定。