初(chu)代測(ce)序(xu)技(ji)術分類(lei)及原(yuan)理(li)

1977年Sanger和Gilbert分別提出雙脫氧(yang)鏈終(zhong)止(zhi)法(fa)和化學降解法(fa)測(ce)序(xu)法(fa)，標誌著初(chu)代測(ce)序(xu)技(ji)術的誕生(sheng)。

 
初(chu)代測(ce)序(xu)技(ji)術分類(lei)
 
Maxam-Gilbert化學降解法(fa)測(ce)序(xu)
 
1. 測(ce)序(xu)原(yuan)理：先對(dui)DNA片段的5'或3'端進行(xing)放射(she)性(xing)標記，再采用(yong)特異(yi)性(xing)化學試劑(ji)修飾和裂(lie)解特定的堿(jian)基位(wei)點，從(cong)而得到(dao)壹系列(lie)有(you)共同(tong)放(fang)射(she)起(qi)點(dian)但(dan)長(chang)度(du)不(bu)壹的DNA片段(duan)混(hun)合物，通過對此(ci)混(hun)合物進行(xing)聚(ju)丙(bing)烯酰(xian)胺(an)凝膠電泳即可從(cong)放(fang)射自顯(xian)影片直(zhi)接讀出DNA堿(jian)基序(xu)列(lie)。
 
2. 堿(jian)基序(xu)列(lie)的識(shi)讀：聚(ju)丙(bing)烯酰(xian)胺(an)凝膠電泳可(ke)以將(jiang)DNA片(pian)段(duan)混(hun)合物按(an)片段(duan)大小(xiao)分開(kai)，片(pian)段越小(xiao)越接近(jin)凝膠底部(bu)。因為(wei)化學降解反(fan)應(ying)並(bing)非(fei)絕對的堿(jian)基特異(yi)性(xing)反(fan)應(ying)，在(zai)識(shi)讀時(shi)需從A+G泳(yong)道(dao)中扣除G泳(yong)道的條帶而(er)推斷A堿(jian)基，從(cong)C+T泳道(dao)中扣除C泳(yong)道的條帶而(er)推斷T堿(jian)基，即若A+G泳(yong)道(dao)中出現壹條帶且G泳道(dao)中有(you)相(xiang)同大小(xiao)的帶，則(ze)識(shi)讀為(wei)G堿(jian)基，若G泳(yong)道(dao)中沒有(you)相(xiang)同大小(xiao)的帶，則(ze)識(shi)讀為(wei)A堿(jian)基。^[1]
 
 
圖1 化學降解法(fa)測(ce)序(xu)反(fan)應(ying)示(shi)意(yi)圖
在不(bu)同點切(qie)割(ge)相同(tong)的DNA標記片段會(hui)產生(sheng)不(bu)同大小(xiao)的標記片段，然(ran)後(hou)通過凝膠電泳分離(li)片(pian)段
 
但(dan)由於(yu)化學降解法(fa)測(ce)序(xu)技(ji)術對(dui)待(dai)測(ce)DNA要(yao)求(qiu)較(jiao)高、操作(zuo)繁瑣、試(shi)劑(ji)毒性(xing)大、放射性(xing)標記率偏低等原(yuan)因，並(bing)未(wei)得到(dao)廣(guang)泛(fan)應(ying)用(yong)。
 
Sanger雙(shuang)脫氧(yang)鏈終(zhong)止(zhi)法(fa)測(ce)序(xu)
 
1. 測(ce)序(xu)原(yuan)理：以待(dai)測(ce)單鏈DNA為(wei)模(mo)板(ban)，在引物的引導(dao)下(xia)依(yi)據堿(jian)基互(hu)補(bu)配(pei)對(dui)的原則(ze)，隨(sui)機(ji)引入底(di)物：4種(zhong)dNTP(dATP、dTTP、dCTP、dGTP)和4種(zhong)ddNTP(ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP)。在(zai)DNA聚(ju)合酶的作(zuo)用(yong)下(xia)，若引(yin)入(ru)dNTP則(ze)新(xin)生(sheng)鏈繼(ji)續延(yan)伸，若引(yin)入(ru)ddNTP則(ze)新(xin)生(sheng)鏈合成終(zhong)止(zhi)。因此(ci)反(fan)應(ying)結束(shu)後(hou)體(ti)系中得到(dao)壹系列(lie)長(chang)度(du)不(bu)壹的DNA片段(duan)混(hun)合物，通過電泳(yong)對此(ci)混(hun)合物按(an)分子量(liang)大小(xiao)分開(kai)即可讀出DNA堿(jian)基序(xu)列(lie)。
 
 
圖2 傳統(tong)（a） VS 改(gai)進後(hou)（b）Sanger法(fa)測(ce)序(xu)原(yuan)理示意(yi)圖
 
傳統(tong)Sanger測(ce)序(xu)采用(yong)放(fang)射性(xing)核素標(biao)記引物，分成(cheng)4管反(fan)應(ying)體(ti)系，通過平板(ban)聚(ju)丙(bing)烯凝膠電泳對(dui)PCR產物進行(xing)分離(li)。而(er)改(gai)進後(hou)的Sanger測(ce)序(xu)采用(yong)熒(ying)光素(su)標記標記ddNTP或標記引物，熒(ying)光素(su)標記ddNTP時可實(shi)現(xian)4管反(fan)應(ying)在(zai)同壹管中進行(xing)，通過毛細(xi)管電泳(yong)對PCR產物進行(xing)分離(li)。
 
2. 堿(jian)基序(xu)列(lie)的識(shi)讀：通過電泳(yong)將(jiang)DNA片(pian)段(duan)混(hun)合物按(an)片段(duan)大小(xiao)分開(kai)，傳統(tong)Sanger測(ce)序(xu)利用(yong)放(fang)射自(zi)顯(xian)影技術，人(ren)工讀取(qu)結果(guo)：片段(duan)越小(xiao)越接近(jin)凝膠底部(bu)，由底(di)部(bu)向上(shang)依(yi)次(ci)讀出新合成鏈的5'→3'方向(xiang)的DNA堿(jian)基序(xu)列(lie)。
 
而(er)改(gai)進後(hou)的Sanger測(ce)序(xu)利用(yong)熒(ying)光信(xin)號采集技術，自(zi)動(dong)化讀取(qu)結果(guo)：片段(duan)越小(xiao)越先(xian)通過熒(ying)光信(xin)號采集器(qi)，由通過時間(jian)的先後(hou)和熒(ying)光信(xin)號自動(dong)記錄堿(jian)基序(xu)列(lie)。
 
 
初(chu)代測(ce)序(xu)技(ji)術特點(dian)及應(ying)用(yong)
 
Sanger測(ce)序(xu)法(fa)自面世(shi)以來(lai)經過40年的不(bu)斷發(fa)展(zhan)，讀長(chang)可(ke)達(da)1000bp，測(ce)序(xu)準(zhun)確度(du)高達99%，是(shi)基(ji)因序(xu)列(lie)測(ce)定的金標準(zhun)^[2]。但(dan)此(ci)法的局限(xian)在(zai)於(yu)：只適合對已(yi)知(zhi)突變位(wei)點(dian)進行(xing)檢(jian)測(ce)且只能測(ce)出部(bu)分變異(yi)形式(shi)，如檢(jian)測(ce)點(dian)突變、小(xiao)片段(duan)插(cha)入(ru)/缺(que)失(shi)；通量低(di)，導(dao)致(zhi)需要獲得大量信息(xi)的成本(ben)較(jiao)高；靈敏(min)度(du)較(jiao)低(di)，對於腫(zhong)瘤(liu)樣本(ben)突(tu)變率低於10~15%的變異(yi)，檢(jian)出難(nan)度(du)較(jiao)大^[3]。
 
隨著精(jing)準(zhun)時代(dai)的到(dao)來(lai)，Sanger測(ce)序(xu)法(fa)仍在qPCR檢(jian)測(ce)和高通量測(ce)序(xu)技(ji)術的結果(guo)驗證、鑒定、微(wei)生(sheng)物種(zhong)類(lei)鑒定和科(ke)研等各(ge)個方向發揮(hui)著重(zhong)要(yao)作(zuo)用(yong)。Sanger測(ce)序(xu)法(fa)為我們打開(kai)了(le)合成測(ce)序(xu)的大門，同時(shi)為(wei)大規模(mo)基(ji)因組(zu)測(ce)序(xu)的誕生(sheng)奠(dian)定了基(ji)礎。
      蘇(su)州(zhou)阿(e)爾(er)法生(sheng)物實(shi)驗器(qi)材有(you)限(xian)公(gong)司(si)提供的基因測(ce)序(xu)儀(yi)、凝膠成像儀(yi)、電泳儀、電(dian)泳槽、PCR擴(kuo)增儀(yi)等廣(guang)泛(fan)應(ying)用(yong)於(yu)初(chu)代測(ce)序(xu)。