實(shi)時(shi)熒光定量 PCR技(ji)術(shu)

實(shi)時熒光定量 PCR，簡(jian)稱 RT-QPCR, 屬(shu)於 Q-PCR 的壹(yi)種，目前(qian)該技(ji)術(shu)已(yi)得(de)
到廣(guang)泛應(ying)用(yong)，如(ru)：擴(kuo)增特異性分(fen)析、基因(yin)定量分(fen)析、基因(yin)分(fen)型(xing)、SNP 分(fen)析等。熒
光定量 PCR 常(chang)用(yong)的方(fang)法是(shi) DNA 結合(he)染料(liao) SYBR GreenⅠ的(de)非特異性方(fang)法和(he)
Taqman 水解(jie)探(tan)針的特異性方(fang)法。
 
SYBR Green I 是(shi)壹(yi)種結合(he)於所有(you) dsDNA 雙螺旋(xuan)小(xiao)溝區(qu)域(yu)的(de)具(ju)有綠色(se)激(ji)發(fa)波(bo)
長的熒光染料(liao)，可(ke)與所(suo)有的(de)各(ge)種序列的雙鏈 DNA 分(fen)子(zi)結合(he)。在(zai)遊離(li)狀態(tai)下，
SYBR Green I 發(fa)出微弱的熒光，但(dan)壹(yi)旦與雙鏈 DNA 結合(he)，嵌(qian)入(ru)至 dsDNA，熒
光大大增強(qiang)。
因此(ci)，SYBR Green I 的(de)熒光信(xin)號強(qiang)度(du)與雙(shuang)鏈 DNA 的數(shu)量相(xiang)關，PCR 擴(kuo)增
不(bu)同(tong)時(shi)期(qi)中(zhong)，dsDNA 含(han)量不同(tong)，SYBR Green I 熒光信(xin)號強(qiang)度(du)不同(tong)。可(ke)以根(gen)據熒
光信(xin)號檢(jian)測(ce)出 PCR 體系存在的(de)雙(shuang)鏈 DNA 數量(liang)，並(bing)可(ke)根據對照進行相關的計(ji)算
和(he)分(fen)析。
實驗(yan)前(qian)準備(bei)
實驗(yan)開始(shi)前(qian)，需準備(bei)好(hao)實驗(yan)所需的各(ge)種試劑和(he)耗(hao)材。
試劑包(bao)括：特異性 PCR 引物，新鮮(xian)提取(qu)備(bei)用(yong)的總 RNA。
使(shi)用(yong)的試(shi)劑盒有：用(yong)於合成(cheng) cDNA 第壹鏈的羅(luo)氏(shi)試(shi)劑盒 Transcriptor First
Strand cDNA Synthesis Kit，包含(han)了(le) cDNA 反應(ying)所(suo)需要(yao)的所有實驗(yan)組分(fen)以及(ji)相(xiang)關
的正(zheng)對照反應組分(fen)。配(pei)套 LightCycler® 480 使(shi)用(yong)的試(shi)劑盒 LightCycler® 480 SYBR Green I Master，
包含(han)了(le) PCR 所需的各(ge)種實驗(yan)組分(fen)，如(ru) 1 號管中包含熱(re)啟動 Taq DNA Polymerase
及(ji)反應緩沖(chong)液，dNTP mix，SYBR Green I 染料(liao)和(he) MgCl2
正(zheng)式(shi)試(shi)驗(yan)開始(shi)前(qian)，冰上(shang)解(jie)凍(dong)各(ge)個試(shi)劑及(ji)試(shi)劑盒組分(fen)，置於冰上(shang)待(dai)用(yong)。註(zhu)意(yi)：
SYBR Green I Master 需避光(guang)放(fang)置。
所需儀器(qi)與(yu)耗(hao)材有： LightCycler® 480 全自動實(shi)時定量 PCR 儀以及(ji)配(pei)
套使(shi)用(yong)的 96 或(huo) 384 多孔板，透明封(feng)板(ban)膜等(deng)壹(yi)次性(xing)耗材。朗基T30 PCR 儀、rainin單(dan)道移(yi)液器(qi)、Nunc 冰(bing)盒及NEST 盒裝吸頭(tou)等(deng)。
 
實驗(yan)操作流程(cheng)：
1.用(yong)新鮮(xian)提取(qu)的(de) RNA 反(fan)轉(zhuan) 錄(lu)合成(cheng) cDNA 第(di)壹鏈，然後進(jin)行實時熒光定量 PCR，其中(zhong)包(bao)括：SYBR Green 反 應體系的(de)配(pei)置；PCR 程(cheng)序(xu)設(she)置；運行 PCR 實驗(yan)，樣(yang)品(pin)編(bian)輯(ji)和(he)結果(guo)分(fen)析。
2.反轉(zhuan)錄(lu)反應(ying) :
反(fan)轉(zhuan)錄(lu)合成(cheng) cDNA 第(di)壹鏈實驗(yan)操作時註(zhu)意(yi)：所有(you) RNA 相關(guan)的操作均(jun)要(yao)佩戴手套，防止 RNase 汙(wu)染。
相關(guan)操作嚴(yan)格(ge)按照試劑盒使(shi)用(yong)說(shuo)明進行相關操作。
按照體系配(pei)方(fang)在冰(bing)上的(de) Rnase free 的滅菌(jun) PCR 管中配(pei)置 Template primer mix，
總體系 13μl，本(ben)實(shi)驗(yan)是(shi)聯(lian)合使(shi)用(yong) anchored oligo dT 引物和隨機(ji)六聚體引物進行
的反轉(zhuan)錄(lu)。先(xian)配(pei)置 NTC 對照，加入(ru) 9 號管水 10μl、 6 號管的 50mM oligo dT 引
物 1μl、5 號管的 0.6mM 隨機(ji)六聚體引物 2μl，混勻(yun)。然後進(jin)行樣(yang)品(pin)壹(yi)號管的體
系配(pei)置，依次(ci)加入(ru) 1μl 已調(tiao)整濃(nong)度(du)的總 RNA、1μl oligo dT 引物、2μl 隨機(ji)六聚體
引物、最後加(jia) 9μl 水補(bu)充至(zhi)總體積 13μl，混勻(yun)。其他(ta)樣(yang)品(pin)管，參(can)照 1 號管的配(pei)置
方(fang)法，依次(ci)加好反(fan)應(ying)體系。
註(zhu)意(yi)：可(ke)將總RNA的(de)模板量適(shi)當調(tiao)整至(zhi) 10ng-5μg，mRNA調整(zheng)至 1-100ng。
若 RNA 樣(yang)品(pin)濃(nong)度(du)較低，則可(ke)加入(ru) 10μg/ml 的 MS2 RNA 來(lai)穩定模板 RNA。
將配(pei)好的(de)反應(ying) mix 在(zai) PCR 儀中(zhong) 65℃變性 10min，可(ke)有效(xiao)減少(shao) RNA 的二(er)級
結構(gou)。加熱(re)後迅(xun)速置於冰上(shang)驟冷，放(fang)置 5min。
在反(fan)應 Template primer mix 中(zhong)按體系配(pei)方(fang)順序(xu)，依次(ci)加入(ru)以下試劑：2 號管
的 5×反轉(zhuan)錄(lu)酶 buffer，4 號管 dNTP mix，3 號管 40 U/μl 的 RNase 抑(yi)制劑，1 號
管 20 U/μl 的反轉(zhuan)錄(lu)酶，最(zui)終(zhong)體積為 20μl。
若樣(yang)品(pin)數(shu)較多(duo)，先(xian)配(pei)置反應(ying) mix 再分(fen)裝，小心(xin)吸打混合(he)，切勿渦(wo)旋(xuan)振(zhen)蕩。混勻(yun)後於瞬時(shi)離(li)心(xin)機(ji)上(shang)短暫(zan)離(li)心(xin)，使(shi)樣(yang)品(pin)和(he)反應(ying)液落(luo)至離(li)心(xin)管底部。
將離(li)心(xin)管放(fang)置 PCR 中，根(gen)據使(shi)用(yong)的引物以及(ji)目(mu)標 mRNA 的片(pian)段(duan)長度(du)進(jin)行程(cheng)
序(xu)設(she)置。本實(shi)驗(yan)反應(ying)溫度和時間設(she)置為：25℃，10min，55℃反應(ying) 30min。反(fan)應完畢(bi)後，於 85℃下加熱(re) 5min 滅活(huo)反(fan)轉(zhuan)錄(lu)酶，再置於冰上(shang)停止反(fan)應(ying)。
此(ci)反(fan)應(ying)產物可(ke)於 2-8℃存放(fang) 1-2h，或在(zai)-15 至-25℃下存放(fang)更長時(shi)間(jian)。
3. Q-PCR 擴(kuo)增
cDNA 產物無需進行純化(hua)即(ji)可(ke)用(yong)於後續(xu)的 PCR 反(fan)應。20μl 的(de) PCR 反(fan)應(ying)體系
可(ke)取(qu) 2-5μl cDNA 反(fan)應(ying)產物進行擴(kuo)增。此(ci)試(shi)劑盒中的(de)反(fan)轉(zhuan)錄(lu)酶具(ju)有(you) RNase H 活性，
可(ke)以在(zai) cDNA 合(he)成之後去(qu)除 RNA 模版，減(jian)少(shao)其對後續(xu) PCR 的影(ying)響。
本(ben)部分(fen)實驗(yan)，我(wo)們選(xuan)用(yong) SYBR Green I Master 試劑盒進行定量分(fen)析。
本實驗(yan)共(gong)設(she)置 5 個標(biao)準樣(yang)品(pin)，包(bao)含 1 個標(biao)記為 0 的空白(bai)對照，5 個反(fan)轉(zhuan)錄(lu)樣(yang)
品(pin)，包(bao)含 NTC 對照，由(you)於樣(yang)品(pin)數(shu)較多(duo)，先(xian)配(pei)制不(bu)含(han)模版的(de)總體系，再分(fen)裝為 10
管，加入(ru)各(ge)個樣(yang)品(pin)的(de)模板後，再將每(mei)個樣(yang)品(pin)分(fen)裝為 3 個復孔。
按照體系配(pei)方(fang)分(fen)別(bie)加入(ru)綠色(se)蓋(gai)子(zi)的(de) 2×Master Mix，10x Primer 上下遊引物，
PCR 級別(bie)水。總體系配(pei)好後，在(zai)用(yong)移(yi)液槍輕(qing)柔吸打均(jun)勻(yun)，然後分(fen)裝為 10 管，每(mei)
管 55μl。往 10 管中分(fen)別(bie)加入(ru)各(ge)個樣(yang)品(pin)對應的調整(zheng)好(hao)濃(nong)度(du)的 cDNA。
STD 零(ling)加入(ru) 6μl 水代(dai)替模板，其余 STD 分(fen)別(bie)加入(ru) 6μl 已經(jing)逐級稀(xi)釋好(hao)的(de)標(biao)
樣(yang)模板。反轉(zhuan)錄(lu)樣(yang)品(pin)分(fen)別(bie)加入(ru) 6μl 濃(nong)度(du)調整好(hao)的(de)模板 DNA，包含(han) NTC。混勻(yun)，
然後將每(mei)個樣(yang)按 20μl 每(mei)孔分(fen)裝至 96 孔板中(zhong)。用(yong)封(feng)孔膜蓋(gai)好(hao) 96 孔板，將多孔板
置於合適(shi)的離(li)心(xin)機(ji)中(zhong) 1500×g 配(pei)平離(li)心(xin) 2min 將準備(bei)好(hao)的 96 孔板放(fang)置在 LightCycler® 480 設(she)備中(zhong)。
4.程(cheng)序(xu)設(she)定
雙擊(ji)打開 LightCycler® 480 的 1.5 軟件(jian)並(bing)登(deng)陸(lu)，自動進(jin)入(ru)軟件(jian)界(jie)面(mian)，點(dian)擊(ji) new
experiment,在(zai) Detection Format 選項(xiang)中(zhong)選擇 SYBR Green I 模式, 點擊(ji) OK 完(wan)成(cheng)檢
測通(tong)道的設定,
接下來設(she)置反應(ying)體積，對於 96 模塊，反應(ying)體系為 10μl-100μl 之間(jian)，本(ben)實驗(yan)
是(shi)設(she)定 20μl 的反(fan)應(ying)體系。
在(zai) Program Name 中(zhong)輸(shu)入(ru)反應(ying)名稱 pre incubation，預變性設定 1 個循(xun)環(huan)，
無需進行熒光的收(shou)集(ji)，執(zhi)行的溫度和(he)時(shi)間(jian)設定為 95℃ 10min，視圖(tu)會根(gen)據設(she)定
進行實時的調(tiao)整(zheng)。點(dian)擊增(zeng)加按鈕，輸(shu)入(ru) Amplification，定義(yi)擴(kuo)增循(xun)環(huan)的(de)次(ci)數(shu)為 45 次，並(bing)選擇(ze)
熒光的收(shou)集(ji)功能(neng) Quantification，然後設(she)定 PCR 擴(kuo)增循(xun)環(huan)的(de)溫(wen)度(du)與時(shi)間為 95℃ 10
s，點擊(ji)增(zeng)加按鈕，設定退火溫度和(he)時(shi)間(jian)為 60℃ 10s，以上(shang)兩步 Acquisition Mode
都(dou)默認選(xuan)擇 None，繼續(xu)點擊(ji)增加按鈕，設置延伸(shen)溫度(du)和時(shi)間為 72℃ 20s，
Acquisition Mode 選擇(ze) Single，Ramp Rate 均(jun)按自動調(tiao)整值，無需再設(she)置。
設置溶解(jie)曲(qu)線(xian)，在(zai) Program 中(zhong)的(de)新的壹(yi)行中輸(shu)入(ru) Melting Curves，1 個循(xun)環(huan)
數(shu)，Analysis Mode 選(xuan)擇(ze) Melting Curves，時間(jian)和溫(wen)度設置為 95℃ 5s，點擊(ji)增(zeng)加
按鈕，新增設(she)置溫度(du)和時(shi)間為 65℃ 1min，以上(shang)兩步 Acquisition Mode 都(dou)默認選(xuan)
擇 None。點擊(ji)增加(jia)按鈕，新增設(she)置溫度(du)為 95℃，Acquisition Mode 選擇(ze) Continuous,，
其他(ta)設(she)置無需改動。
設(she)置保溫的過(guo)程(cheng) Cooling，只(zhi)需 1 個循(xun)環(huan)，無需收集(ji)熒光，設定溫度(du)和(he)時間
為 40℃、1min。設置完成(cheng)後點(dian)擊右邊(bian)的保存按鈕保存設置的程(cheng)序(xu)。此(ci)時(shi)整(zheng)個 PCR
的(de)循(xun)環(huan)體系、溫(wen)度(du)的(de)設(she)置已經(jing)設定完畢(bi)。
點(dian)擊 Start run 開始(shi)運行 PCR 反應，此(ci)時(shi)可(ke)在軟件(jian)上(shang)實時監測樣(yang)品(pin)擴(kuo)增情況。
5.樣(yang)品(pin)編(bian)輯(ji)
實(shi)驗(yan)結束(shu)，點(dian)擊 Sample Editor，進入(ru)樣(yang)本(ben)編(bian)輯(ji)區(qu)。
Select Workflow 中(zhong)選擇 Abs Quant。根據樣(yang)本(ben)在(zai)板(ban)中(zhong)排布(bu)的(de)方(fang)式進(jin)行樣(yang)本(ben)編(bian)
輯(ji)。設(she)置陰性(xing)對照、空白(bai)對照、標準品(pin)以及(ji)未(wei)知(zhi)樣(yang)品(pin)等(deng)。
在 Select Sample 中(zhong)，選(xuan)中(zhong)需要(yao)設置的樣(yang)品(pin)孔。在下壹欄(lan)中的(de) Sample Name
輸(shu)入(ru)被(bei)選(xuan)擇(ze)樣(yang)品(pin)組的(de)名(ming)稱，並(bing)在 Sample Type 中(zhong)選擇樣(yang)品(pin)組的(de)類型(xing)，最(zui)後點(dian)擊
Make Replicates 設(she)置復孔。標準(zhun)品(pin)設(she)置時，需填(tian)寫(xie)拷(kao)貝(bei)數，只(zhi)需填(tian)寫(xie)好稀(xi)釋倍(bei)數(shu)，
初始濃(nong)度(du)即(ji)可(ke)。編(bian)輯(ji)好(hao)樣(yang)品(pin)後，即(ji)可(ke)進行數據分(fen)析。如(ru)有(you)需要(yao)，也可(ke)進行子(zi)集(ji)編(bian)
輯(ji)。
6.結果(guo)分(fen)析
樣(yang)品(pin)編(bian)輯(ji)好(hao)後，可(ke)進行實驗(yan)結果(guo)分(fen)析。
點擊左邊欄下方(fang)的 sum 按鈕，相應出現(xian)實(shi)驗(yan)的所(suo)有信(xin)息，包(bao)括：設計的反(fan)
應(ying)程(cheng)序(xu)，實(shi)驗(yan)結果(guo)分(fen)析等。
點擊 analysis，可(ke)以根(gen)據樣(yang)品(pin)已(yi)有的(de)數(shu)據進(jin)行細(xi)致(zhi)準(zhun)確(que)地(di)分(fen)析。點擊 Abs Quant second derivative max，彈出 create new analysis 窗(chuang)口，在(zai) Subset
選(xuan)項(xiang)中(zhong)選擇分(fen)析樣(yang)品(pin)的(de)分(fen)布(bu)區(qu)域(yu)，點擊(ji)確(que)定，即(ji)可(ke)出現(xian)分(fen)析圖(tu)：相應(ying)樣(yang)品(pin)的(de)擴(kuo)增
曲(qu)線(xian)。
Standard Curve 是(shi)根(gen)據標(biao)準(zhun)品(pin)得(de)出的(de)標(biao)準曲線，曲線(xian)左(zuo)側(ce)標(biao)有(you)擴(kuo)增效(xiao)率(lv)、斜
率(lv)、截距(ju)、線性關(guan)系、以及(ji)錯(cuo)誤率(lv)。壹般(ban)“Error"值(zhi)越小(xiao)，說(shuo)明實驗(yan)的準(zhun)確率(lv)越高。
擴(kuo)增效(xiao)率(lv)如(ru)果(guo)越接近“2"，說(shuo)明這次的(de)擴(kuo)增反(fan)應(ying)越好(hao)。
在(zai)數據表(biao)格(ge)，可(ke)顯示(shi)單(dan)個樣(yang)本(ben)的(de) Cp 值(zhi)，以及(ji)相(xiang)應的樣(yang)本(ben)濃(nong)度(du)值。
按復孔進行數據統計(ji)，顯示(shi) Cp 平(ping)均(jun)值，方(fang)差(cha)，濃(nong)度(du)的平均(jun)值以及(ji)方(fang)差(cha)。
蘇(su)州阿(e)爾法生(sheng)物提供的(de)實(shi)時熒光定量PCR儀、高速離(li)心(xin)機(ji)、恒(heng)溫(wen)混勻(yun)儀、rainin移(yi)液器(qi)等(deng)試(shi)驗(yan)設備(bei)及1.5ml離(li)心(xin)管、pcr管、酶標板等(deng)實(shi)驗(yan)耗材，廣(guang)泛用(yong)於熒光定量PCR實(shi)驗(yan)。