CCK-8法進行(xing)細(xi)胞(bao)毒性(xing)檢測的方(fang)法

CCK-8法進行(xing)細(xi)胞(bao)毒性(xing)檢測的方(fang)法

CCK-8法是(shi)細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)和細(xi)胞(bao)毒性(xing)檢測常(chang)用的壹(yi)種(zhong)檢(jian)測方(fang)法，其具(ju)體操作方(fang)法如(ru)下：
1.制(zhi)備(bei)細(xi)胞(bao)懸液(ye)：選取(qu)生長狀(zhuang)態(tai)良好(hao)的對(dui)數(shu)生長期(qi)細(xi)胞(bao)制(zhi)作細(xi)胞(bao)懸液(ye)，並計(ji)數(shu)。
2.在96孔(kong)板中(zhong)接種(zhong)細(xi)胞(bao)懸液(ye) (100 μL/孔)。
3.將(jiang)培養(yang)板置於(yu)培(pei)養(yang)箱中(zhong)預培養（37℃，5% CO2）12-24小(xiao)時，使(shi)細(xi)胞(bao)達(da)到指(zhi)數(shu)期（培(pei)養時間(jian)根(gen)據細(xi)胞(bao)種(zhong)類(lei)的不(bu)同(tong)和每(mei)孔內(nei)細(xi)胞(bao)數(shu)量的多(duo)少而異(yi)）。
4.吸(xi)出各(ge)孔(kong)培(pei)養基，向培養(yang)板加(jia)入10μL不(bu)同(tong)濃度(du)的待(dai)測藥(yao)物進行(xing)幹(gan)預。（實(shi)驗(yan)組(zu)加(jia)入含(han)不(bu)同(tong)濃度(du)藥物的培(pei)養(yang)基，空白(bai)組(zu)加(jia)入不(bu)含(han)藥(yao)物培養(yang)基(ji)）
5.將(jiang)培(pei)養(yang)板在培(pei)養(yang)箱(xiang)（37℃，5% CO2）培(pei)養壹(yi)段(duan)適(shi)當的時間(jian)（例(li)如(ru)：6、12、24或48小時，具(ju)體時間(jian)壹(yi)般(ban)根(gen)據細(xi)胞(bao)周(zhou)期來決(jue)定）。
6.每(mei)孔加(jia)入10ul CCK-8試(shi)劑(ji)。①在做(zuo)加(jia)藥實(shi)驗(yan)時，還(hai)應考(kao)慮(lv)藥(yao)物的吸(xi)收。如(ru)果(guo)實(shi)驗(yan)中(zhong)待(dai)測物質有(you)氧化(hua)還原(yuan)劑(ji)，在不(bu)含(han)細(xi)胞(bao)的培(pei)養(yang)基中(zhong)加(jia)入藥(yao)物，然後(hou)加(jia)入CCK-8試(shi)劑(ji)在壹(yi)定時間(jian)內(nei)檢(jian)測，和(he)不(bu)加(jia)藥物的培(pei)養(yang)基進行(xing)比(bi)較(jiao)（只(zhi)加(jia)CCK-8試(shi)劑(ji)），如(ru)果(guo)OD值明顯偏高(gao)，則(ze)說(shuo)明有(you)反應。
②可在(zai)加(jia)CCK-8之前(qian)更換新鮮培養(yang)基(ji)（除(chu)去(qu)培(pei)養(yang)基(ji)，並(bing)用培(pei)養基(ji)洗(xi)滌(di)細(xi)胞(bao)兩次(ci)，然後(hou)加(jia)入新(xin)的培(pei)養(yang)基），去(qu)掉藥物對實(shi)驗(yan)的影(ying)響(xiang)。
③當然藥物影(ying)響(xiang)比較(jiao)小(xiao)的情(qing)況(kuang)下，可以(yi)不(bu)更換培養基，直(zhi)接扣除(chu)培(pei)養基(ji)中(zhong)加(jia)入藥(yao)物後(hou)的空白(bai)吸(xi)收即可。5.將培養(yang)板置於(yu)培(pei)養(yang)箱內(nei)繼(ji)續培養1-4小時：
6.使(shi)用酶標儀檢測450nm波長的吸(xi)光(guang)度（OD值）按公(gong)式(shi)計(ji)算：
細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)（%）=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%
細(xi)胞(bao)抑制(zhi)率（%）=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%
As: 實(shi)驗(yan)組(zu)吸(xi)光(guang)度 (含(han)細(xi)胞(bao)、培養(yang)基、CCK-8 溶液(ye)和藥(yao)物溶液(ye))；
Ac: 對照(zhao)組吸(xi)光(guang)度 (含(han)細(xi)胞(bao)、培養(yang)基、CCK-8 溶液(ye)，不(bu)含(han)藥(yao)物)；
Ab: 空白(bai)組(zu)吸(xi)光(guang)度 (含(han)培(pei)養(yang)基(ji)、CCK-8 溶液(ye)，不(bu)含(han)細(xi)胞(bao)、藥物)。

 
CCK-8法進行(xing)細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)指(zhi)細(xi)胞(bao)增(zeng)殖(zhi)活(huo)力(li)或細(xi)胞(bao)毒性(xing)檢測時的註(zhu)意(yi)事(shi)項：
 
由於CCK-8是(shi)通(tong)過和細(xi)胞(bao)內(nei)的脫(tuo)氫(qing)酶進行(xing)反應間(jian)接反映活(huo)細(xi)胞(bao)數(shu)量，如(ru)果(guo)細(xi)胞(bao)已經(jing)死亡，但(dan)脫(tuo)氫(qing)酶的活(huo)性還(hai)在，則(ze)試(shi)劑(ji)測定的細(xi)胞(bao)數(shu)量將(jiang)會比(bi)真實(shi)值高(gao)，不(bu)能真實(shi)反映活(huo)細(xi)胞(bao)數(shu)量，建(jian)議采用別(bie)的方(fang)法測定。
 
由於 CCK-8 分析基(ji)於(yu)活(huo)細(xi)胞(bao)中(zhong)脫氫(qing)酶活(huo)性的檢(jian)測，因(yin)此影(ying)響(xiang)活(huo)細(xi)胞(bao)中(zhong)脫氫(qing)酶活(huo)性的條(tiao)件(jian)或化學(xue)物質可(ke)能會導(dao)致(zhi)實(shi)際活(huo)細(xi)胞(bao)數(shu)與(yu)使用 CCK-8 分(fen)析確(que)定的細(xi)胞(bao)數(shu)之間(jian)存(cun)在(zai)差異(yi)。
 
考(kao)慮(lv)到不(bu)同(tong)類型細(xi)胞(bao)代謝(xie)水平存(cun)在(zai)差異(yi)，有(you)些細(xi)胞(bao)在藥(yao)物處(chu)理後(hou)，可能活(huo)細(xi)胞(bao)數(shu)不(bu)變，但是(shi)有(you)氧代(dai)謝(xie)能力(li)降低後(hou)，NAD+產生減(jian)少，測出(chu)的Formazan也(ye)會減(jian)少。
 
CCK8可以(yi)檢測大(da)腸桿(gan)菌(jun)，但不(bu)能檢測酵(jiao)母細(xi)胞(bao)。
 
在細(xi)胞(bao)增(zeng)殖(zhi)實(shi)驗(yan)每(mei)次(ci)測定的過程中(zhong)需要(yao)避免(mian)細(xi)菌(jun)汙染，以(yi)免影(ying)響(xiang)結果。
 
金(jin)屬(shu)對(dui)CCK-8顯(xian)色有(you)影(ying)響(xiang)：當終(zhong)濃(nong)度(du)為(wei)1mM的氯化亞鉛、氯化鐵、硫(liu)酸(suan)銅(tong)會抑制(zhi)5%、15%、90%的顯(xian)色反應，使靈(ling)敏度降(jiang)級(ji)。如(ru)果(guo)終(zhong)濃(nong)度(du)是(shi)10 mM的話(hua)，將會*抑制(zhi)。
 
CCK-8試(shi)劑(ji)的顏(yan)色為(wei)淡(dan)紅色，與(yu)含(han)酚紅(hong)的培(pei)養(yang)基顏(yan)色接近，不(bu)註(zhu)意(yi)的話(hua)容易產生漏(lou)加(jia)或多加(jia)。酚紅(hong)和血(xue)清(qing)對(dui)CCK-8法的檢(jian)測不(bu)會造成幹(gan)擾，可以(yi)通(tong)過減(jian)去(qu)空白(bai)孔(kong)中(zhong)本(ben)底(di)的吸(xi)光(guang)度而(er)消除(chu)。
 
混(hun)合(he)或重懸組分(fen)時，避免(mian)產生氣(qi)泡(pao)，因(yin)為(wei)它(ta)們(men)會影(ying)響(xiang)OD值讀(du)取。
 
剛開(kai)始做(zuo)實(shi)驗(yan)時，建(jian)議(yi)先做(zuo)幾(ji)個(ge)孔摸索(suo)接種(zhong)細(xi)胞(bao)的數(shu)量和(he)加(jia)入CCK-8試(shi)劑(ji)後(hou)的培(pei)養(yang)時間(jian)。
 
CCK-8反復(fu)凍(dong)融會增(zeng)加(jia)背景值，幹(gan)擾實(shi)驗(yan)測定。
CCK8的說(shuo)明書大(da)家(jia)壹(yi)定要(yao)認(ren)真(zhen)閱(yue)讀，裏面很多(duo)細(xi)節的問(wen)題都有(you)提(ti)到。而且說(shuo)明書裏提(ti)供的壹(yi)些(xie)關於各種(zhong)細(xi)胞(bao)的種(zhong)板數(shu)都很有(you)參考(kao)價值，因(yin)為(wei)那(na)是(shi)反復(fu)驗(yan)證(zheng)過的最佳(jia)數(shu)值。
CCK-8法進行(xing)細(xi)胞(bao)毒性(xing)檢測的優(you)勢(shi)：

1、使(shi)用方(fang)便，CCK-8細(xi)胞(bao)活(huo)性檢(jian)測試(shi)劑(ji)中(zhong)為(wei)1瓶(ping)溶液(ye)，可以(yi)直(zhi)接加(jia)入到細(xi)胞(bao)樣品(pin)中(zhong)（懸浮(fu)和貼(tie)壁(bi)細(xi)胞(bao)均適(shi)用），不(bu)需要(yao)預配各種(zhong)成(cheng)分(fen)，不(bu)需要(yao)對(dui)細(xi)胞(bao)進行(xing)過多的處(chu)理，也(ye)不(bu)必(bi)添(tian)加(jia)放射(she)性同(tong)位素、有(you)機(ji)溶劑(ji)等，且(qie)能夠快速(su)進行(xing)檢(jian)測；
2、CCK-8法的檢(jian)測靈(ling)敏度很(hen)高(gao)，甚至(zhi)可(ke)以(yi)測定較(jiao)低細(xi)胞(bao)密(mi)度；
3、CCK-8法的重(zhong)復(fu)性(xing)優(you)於MTT 法，MTT 實(shi)驗(yan)生(sheng)成的formazan 不(bu)是(shi)水(shui)溶性的，需要(yao)使(shi)用DMSO 等(deng)有(you)機(ji)溶劑(ji)溶解(jie)；
4、而本(ben)方(fang)法產生的formazan 是(shi)水(shui)溶性的，不(bu)僅(jin)省(sheng)去(qu)了(le)溶解(jie)步(bu)驟，更因(yin)此而減(jian)少了該操作步(bu)驟帶(dai)來的誤差(cha)；
5、CCK-8法對細(xi)胞(bao)毒性(xing)小，可以(yi)多次(ci)測定選取最佳(jia)測定時間(jian)，與(yu)MTT 方(fang)法相比線性(xing)範(fan)圍更寬(kuan)，靈(ling)敏度更高(gao)；
6、CCK-8 對細(xi)胞(bao)的毒(du)性(xing)非(fei)常(chang)低，其(qi)他(ta)的實(shi)驗(yan)，例(li)如(ru)中(zhong)性紅(hong)法或結晶(jing)紫法 ，也可(ke)在 CCK-8 法檢測完(wan)後(hou)繼(ji)續進行(xing)。
     蘇(su)州(zhou)阿(e)爾法生物提(ti)供的酶標儀、移液(ye)槍、Co2培(pei)養箱(xiang)、顯微鏡、細(xi)胞(bao)計數(shu)儀等實(shi)驗(yan)室(shi)設(she)備(bei)和酶標板、96孔板、離(li)心管(guan)、PCR八聯(lian)排管(guan)、移液(ye)槍吸(xi)頭等(deng)實(shi)驗(yan)耗(hao)材以(yi)及CCK-8試(shi)劑(ji)盒、PBS緩沖液(ye)、培養(yang)基等(deng)生物試(shi)劑(ji)用於(yu)CCK-8細(xi)胞(bao)毒性(xing)和細(xi)胞(bao)活(huo)力(li)檢測。