CCK-8細胞活性檢(jian)測實驗步(bu)驟(zhou)

  CCK-8實驗(yan)可(ke)用(yong)於細胞因子(zi)等(deng)誘(you)導(dao)的細胞增(zeng)殖檢(jian)測，也(ye)可(ke)以(yi)用於(yu)抗癌藥(yao)物等對(dui)細胞有(you)毒(du)試劑(ji)誘(you)導(dao)的細胞毒(du)性(xing)檢(jian)測，或(huo)壹(yi)些(xie)藥(yao)物誘(you)導(dao)的細胞生(sheng)長(chang)抑制檢(jian)測。使用酶(mei)標(biao)儀(yi)在450nm波(bo)長(chang)處測OD值(zhi)，可(ke)間(jian)接性(xing)反(fan)應(ying)活細胞的數量。使用CCK-8試劑(ji)盒進(jin)行細胞活性檢(jian)測是壹種高(gao)靈(ling)敏(min)度，無(wu)放(fang)射(she)性(xing)的比(bi)色(se)檢(jian)測法(fa)。
CCK-8細胞活性檢(jian)測實驗步(bu)驟(zhou)：
壹、實(shi)驗前準備(bei)：
酒精燈、移液(ye)槍(qiang)、酶(mei)標(biao)儀(yi)（帶(dai)有(you)450nm濾光片）、96孔培養板(ban)、CO2培養箱(xiang)、CCK-8、細胞計數板、PBS等。
二、繪(hui)制曲(qu)線(xian)
1.制備(bei)細胞懸液：選取生(sheng)長(chang)狀(zhuang)態良好的對(dui)數生(sheng)長(chang)期(qi)細胞制作(zuo)細胞懸液，並(bing)計數。
2.在96孔板中接(jie)種細胞懸液 (100 μL/孔) ：按(an)比(bi)例(li)依(yi)次用(yong)培養基等(deng)比(bi)稀(xi)釋(shi)成(cheng)壹個細胞濃(nong)度(du)梯(ti)度，壹(yi)般要做(zuo)5-7個(ge)細胞濃(nong)度(du)梯(ti)度（比(bi)如(ru)，稀(xi)釋(shi)10倍，100倍......），每組(zu)4-6個(ge)復孔。
3.繪制標(biao)準曲(qu)線(xian)：接種(zhong)後培養壹(yi)定時(shi)間(jian)待細胞貼(tie)壁後，然後每(mei)100μL培養基加(jia)10μL（10%）CCK-8試劑(ji)培養壹(yi)定時(shi)間(jian)後測定OD值(zhi)，制作(zuo)出壹(yi)條(tiao)以細胞數量為橫(heng)坐(zuo)標(biao)，OD值(zhi)為(wei)縱坐(zuo)標(biao)的標準曲(qu)線(xian)。
根(gen)據(ju)此(ci)標(biao)準曲(qu)線(xian)可(ke)測定出(chu)未(wei)知樣品(pin)在(zai)條(tiao)件壹(yi)致的前提下(xia)的細胞數。
標準曲(qu)線(xian)還有助於確(que)定細胞接(jie)種(zhong)的合(he)適數量以及(ji)摸(mo)索(suo)CCK-8後所需(xu)孵(fu)育(yu)時間(jian)。
三、細胞增(zeng)殖檢(jian)測

1.制備(bei)細胞懸液：選取生(sheng)長(chang)狀(zhuang)態良好的對(dui)數生(sheng)長(chang)期(qi)細胞制作(zuo)細胞懸液，並(bing)計數。
2.在96孔板中接(jie)種細胞懸液 (100 μL/孔) ：根(gen)據(ju)合(he)適的鋪(pu)板細胞數（根(gen)據(ju)自(zi)身的細胞類(lei)型(xing)而定，以(yi)壹(yi)周(zhou)能(neng)鋪(pu)滿(man)為宜，若(ruo)為(wei)血(xue)液(ye)細胞密(mi)度可(ke)適(shi)當增(zeng)大），每(mei)孔接種約100ul細胞懸液，每組設(she)置4-6個(ge)復孔。
①當使用標(biao)準96孔板時，貼(tie)壁細胞的最(zui)小接(jie)種量至少為(wei)1000 個/孔(100μl培養基)。檢(jian)測白細胞時(shi)的靈(ling)敏(min)度相(xiang)對(dui)較(jiao)低，因此(ci)推(tui)薦接種(zhong)量(liang)不低於(yu)2500 個(ge)/孔(100μl培養基)。懸浮細胞由於(yu)染(ran)色(se)比(bi)較(jiao)困難(nan)壹般(ban)需(xu)要增(zeng)加(jia)細胞數量和(he)延長(chang)培養時(shi)間(jian)。
②當在培養箱(xiang)內(nei)培養時(shi)，培養板(ban)最(zui)外壹圈(quan)的孔最(zui)容(rong)易幹(gan)燥揮(hui)發，由於(yu)體(ti)積(ji)不準確(que)而增(zeng)加(jia)誤差(cha)。為減(jian)少誤差(cha)，最(zui)外壹圈(quan)的孔只加100ul PBS、水(shui)或(huo)者(zhe)培養液(ye)，不作(zuo)為測定孔用。
③接種時註意細胞懸液壹定要(yao)混勻，以避(bi)免細胞沈(chen)澱下(xia)來(lai)，導(dao)致每孔中的細胞數量不壹(yi)致。3.將(jiang)培養板(ban)置(zhi)於培養箱(xiang)中預培養（37℃，5% CO2）12-24小(xiao)時(shi)，使細胞達(da)到(dao)指(zhi)數期(qi)（培養時(shi)間(jian)根(gen)據(ju)細胞種(zhong)類(lei)的不同(tong)和(he)每孔內細胞數量的多少而異）。
4.每孔加入(ru)10ul CCK-8試劑(ji)
①由於(yu)每(mei)孔加入(ru)CCK-8量比(bi)較(jiao)少，有(you)可(ke)能(neng)因試劑(ji)沾(zhan)在孔壁上而帶(dai)來(lai)誤差(cha)，建議(yi)直(zhi)接(jie)配(pei)置含10% CCK-8培養基（現用現配）以(yi)換(huan)液的形式(shi)加(jia)入(ru)。註意加CCK-8試劑(ji)時不要(yao)在孔中生(sheng)成(cheng)氣(qi)泡，它們會(hui)影(ying)響OD值(zhi)的讀數。加CCK-8試劑(ji)時速度要(yao)快(kuai)，減少試劑(ji)在移(yi)液(ye)器(qi)上的殘(can)留，加入(ru)CCK-8試劑(ji)後輕(qing)輕(qing)震培養板(ban)。
②加(jia)CCK-8試劑(ji)時間(jian)可(ke)分別在22h、46h、70h、94h時加(jia)入(ru)，也(ye)可(ke)以(yi)在24h、48h、72h、96h時(shi)再加(jia)入(ru)。重要的是需(xu)保證實驗(yan)組和(he)對(dui)照(zhao)組在同(tong)壹(yi)時間點(dian)進(jin)行實驗(yan)。
③若細胞培養時(shi)間(jian)較(jiao)長，培養基顏色或(huo) pH 發(fa)生(sheng)變化(hua)，建議(yi)更(geng)換(huan)培養基後再加(jia) CCK-8。5.將(jiang)培養板(ban)置(zhi)於培養箱(xiang)內(nei)繼續培養0.5-4小(xiao)時(shi)①培養時(shi)間(jian)因孔中細胞的類型(xing)和(he)數量而異，需(xu)要自(zi)己摸索(suo)，因為(wei)細胞種(zhong)類(lei)不同(tong)，形(xing)成Formazan的量也(ye)不壹(yi)樣。
②如(ru)果顯色太淺(qian)的話，可(ke)以(yi)將(jiang)96孔板置於37℃細胞培養箱(xiang)中繼(ji)續培養，可(ke)參(can)考標(biao)準曲(qu)線(xian)確(que)定培養時(shi)間(jian)。
③壹般情(qing)況(kuang)下(xia)，白(bai)細胞著(zhe)色(se)較(jiao)弱，因此(ci)可(ke)能(neng)需(xu)要較(jiao)長的孵(fu)育(yu)時間(jian)（最(zui)多 4 h）或(huo)增(zeng)加(jia)細胞數量。
④CCK-8 的反(fan)應(ying)時(shi)間(jian)以(yi)具(ju)體(ti)顯色的適宜時(shi)間(jian)為準。可(ke)在(zai)0.5h、1.0h、2.0h分別觀(guan)察(cha)培養基的顏色。最(zui)佳OD 值(zhi)控(kong)制在(zai)1.0左(zuo)右較(jiao)合(he)適。6.使用酶(mei)標(biao)儀(yi)檢(jian)測450nm波(bo)長(chang)的吸光度（OD值(zhi)）。實(shi)驗(yan)重復3次(ci)，取實驗(yan)結(jie)果的平(ping)均值(zhi)作(zuo)為最(zui)終(zhong)實驗(yan)結(jie)果。

空(kong)白對(dui)照(zhao)的設(she)定：在(zai)同(tong)體(ti)積(ji)的培養基中加(jia)入(ru)CCK-8，培養同(tong)樣(yang)的時間(jian)，和(he)實驗(yan)組(zu)壹(yi)起測定450nm的吸光度。
①使用酶(mei)標(biao)儀(yi)檢(jian)測時記(ji)得打開96孔板蓋子(zi)，需(xu)保證酶(mei)標(biao)板(ban)的表面(mian)以及(ji)板(ban)底是幹(gan)凈的，且(qie)每(mei)個(ge)待測孔內沒(mei)有氣(qi)泡，以(yi)免幹(gan)擾實驗結(jie)果。
②如(ru)果結(jie)果出現“overflw"則需(xu)降低細胞接(jie)種(zhong)密(mi)度，如(ru)果因實(shi)驗(yan)需(xu)要不能(neng)減少細胞數時可(ke)縮(suo)短(duan)加(jia)入(ru)CCK-8後的培養時(shi)間(jian)。
③如(ru)果樣品為(wei)高渾(hun)濁的細胞懸液，建議(yi)采(cai)用(yong)雙波(bo)長(chang)進(jin)行測定，檢(jian)測波(bo)長(chang)450-490nm，參(can)比(bi)波(bo)長(chang)600-650nm。（CCK-8 在參(can)比(bi)波(bo)長(chang)處沒(mei)有吸(xi)光值(zhi)，設(she)定參(can)比(bi)波(bo)長(chang)的目的是為(wei)了(le)去除(chu)由於(yu)樣(yang)品渾(hun)濁所帶(dai)來(lai)的吸收(shou)。）
④若(ruo)暫時不測定OD值(zhi)，可(ke)以(yi)向每孔中加(jia)入(ru)10μL 0.1M的HCL溶液(ye)或(huo)者(zhe)1% w/v SDS溶(rong)液，並(bing)遮(zhe)蓋培養板(ban)避(bi)光保存在室(shi)溫條(tiao)件下(xia)。24小(xiao)時(shi)內(nei)測定，吸(xi)光度不會(hui)發生(sheng)變化(hua)。
     蘇(su)州阿(e)爾法(fa)生(sheng)物(wu)提供(gong)的酶(mei)標(biao)儀(yi)、移液(ye)槍、Co2培養箱(xiang)、顯(xian)微鏡、細胞計數儀等實驗(yan)室(shi)設(she)備(bei)和(he)酶(mei)標(biao)板(ban)、96孔板、離(li)心管(guan)、PCR八聯(lian)排(pai)管(guan)、移液槍吸頭(tou)等(deng)實(shi)驗耗材(cai)以及(ji)CCK-8試劑(ji)盒、PBS緩沖液、培養基等(deng)生(sheng)物(wu)試劑(ji)用於(yu)CCK-8細胞增(zeng)殖檢(jian)測。