CHO細(xi)胞外泌體的分離(li)和表征(zheng)

CHO細胞外泌體的分離(li)和表征(zheng)

CHO 細(xi)胞是壹(yi)種廣(guang)泛用(yong)於(yu)生物(wu)制(zhi)藥蛋(dan)白質(zhi)生產(chan)的宿(xiu)主。 CHO 細(xi)胞(bao)中分離(li)外泌體主要(yao)采用(yong)聚(ju)合(he)物(wu)的沈(chen)澱(dian) (PBP) 技術(shu)從分(fen)批培(pei)養中分離(li)和富(fu)集細胞(bao)外泌體囊泡(pao)。分(fen)離(li)後的外泌體可以通(tong)過多種方法(fa)來(lai)檢(jian)測和表征(zheng)分(fen)離(li)的囊泡(pao)，這(zhe)些分析包括動(dong)態(tai)光(guang)散(san)射(she) (DLS) 和(he) Zeta 電(dian)位測(ce)量(liang)、電(dian)子(zi)顯(xian)微鏡(jing) (EM) 和外泌體標記物分析、RNA 和(he)脂質(zhi)分析等。
壹(yi)、細胞(bao)培養(yang)
1.培(pei)養基與(yu)細(xi)胞
細胞(bao)可使用(yong)CHO系中的CHO-S 細胞。
培(pei)養(yang)基(ji)使用(yong) CD-CHO 培(pei)養基(ji)（ThermoFisher）。在培(pei)養基(ji)中添加(jia) 8 mM L-谷(gu)氨(an)酰胺利於(yu)CHO細胞(bao)生長。
2. 培養：
培養(yang)物(wu)通(tong)常在錐(zhui)形瓶中以 20 ml 分批培(pei)養模(mo)式在(zai)二(er)氧(yang)化碳(tan)振(zhen)蕩培養(yang)箱(xiang)中 37 °C 下以(yi) 120 rpm 搖動培養。細胞(bao)每 3-5 天(tian)傳代(dai)壹(yi)次，接種率(lv)為 0.2 × 10 ⁶ 個(ge)活細(xi)胞/ml。對(dui)於(yu)制(zhi)備外來體制(zhi)劑(ji)的分批培(pei)養，將細胞以 0.2 × 10 ⁶ 個活細(xi)胞/ml 接種在(zai) 20 ml 培養(yang)物(wu)中，然(ran)後(hou)在(zai)培(pei)養(yang)的第 3 天(tian)和第 5 天(tian)收獲上(shang)清液。
3. 收(shou)獲：
收獲後的樣本，細胞(bao)沈(chen)澱(dian)物(wu)和 5 個(ge) 3 × 10 ⁶細胞沈(chen)澱(dian)物(wu)樣品進行(xing)等分(fen)，用(yong)於(yu)細胞(bao)脂質(zhi)和蛋(dan)白質(zhi)分析。通(tong)過高速離(li)心機以 2,000×g 離(li)心 5 分鐘(zhong)沈(chen)澱(dian)細(xi)胞，並(bing)儲(chu)存(cun)在(zai) - 80 °C超低溫(wen)冰箱中。所有剩余(yu)的(de)培(pei)養(yang)物(wu)上(shang)清液都用(yong)於(yu)分離(li)外泌體，如下所(suo)述。
二(er)、通(tong)過聚(ju)合(he)物(wu)沈(chen)澱(dian)法(fa) (PBP) 制(zhi)備外泌體
根(gen)據制(zhi)造商的指南(nan)，使用(yong) TEI 總外泌體分離(li)試劑(ji)盒（Invitrogen）從(cong)培養基(ji)中分離(li)外泌體。將細胞培養基以(yi) 2000× g離(li)心30 分鐘(zhong)以(yi)去除(chu)細胞(bao)和任(ren)何碎(sui)片(pian)；隨後將上(shang)清液小心移(yi)至離(li)心管(guan)管(guan)中，加(jia)入(ru) 0.5 倍體積的 TEI 試劑(ji)，充(chong)分混(hun)合(he)並(bing)在 4°C 下孵(fu)育(yu)過(guo)夜。然(ran)後(hou)將樣品在 4°C 下以(yi) 10,000× g離(li)心1 小時(shi)，然(ran)後(hou)在(zai)棄去上(shang)清液後(hou)，將富(fu)含外泌體的顆粒(li)重新(xin)懸(xuan)浮在 75 μl PBS 緩(huan)沖液中。然(ran)後(hou)將樣品儲(chu)存(cun)在(zai) - 20°C 下，直(zhi)到需要(yao)進行(xing)後續分(fen)析。
外泌體的表征(zheng)分(fen)析
1.動(dong)態(tai)光(guang)散(san)射(she)
使用(yong) Anton-Paar Lightsizer 500 粒(li)子(zi)分(fen)析儀(yi)測定外泌體制(zhi)劑(ji)中的粒(li)度(du)分(fen)布。動態(tai)光(guang)散(san)射(she)測(ce)量(liang)由(you)於(yu)溶液中粒(li)子(zi)的(de)布朗(lang)運(yun)動(dong)引(yin)起(qi)的散(san)射(she)光(guang)強(qiang)度(du)的(de)動態(tai)波動，（685 nm 的激(ji)光(guang)，檢(jian)測角度(du)為(wei) 15、90、175 度(du)）；較小的粒(li)子(zi)比較大(da)的粒(li)子(zi)移(yi)動得更(geng)快。
確(que)定顆粒(li)大(da)小時(shi)，通(tong)常使用(yong)三(san)種分(fen)布類型：
(1) 數量分布，報告不同(tong)大(da)小“箱"中的顆粒(li)數量；
(2) 體積分布報告不同(tong)尺寸類別的(de)顆(ke)粒(li)總體積；
(3) 強度(du)分(fen)布，報告不同(tong)大(da)小顆粒(li)散(san)射(she)的(de)光(guang)。
也(ye)可以使用(yong)高分辨(bian)率(lv)納(na)米粒(li)徑分析儀(yi) Nanocoulter Ⅰ來分析樣品中每種大(da)小的囊泡(pao)的(de)實際數量、濃度(du)及(ji)粒(li)子(zi)動(dong)態(tai)、Zeta 電(dian)位等。
為(wei)了(le)進行(xing)分析，將先(xian)前(qian)儲(chu)存(cun)在(zai) - 20°C 的(de) 75 μl 等分(fen)試樣的外泌體制(zhi)劑(ji)用(yong) 925 μl PBS 稀(xi)釋（得到 1 ml）並轉移(yi)到壹(yi)次性比色皿(min)中用(yong)於(yu) DLS 測量(liang)。每個樣品在 DLS 和(he) Zeta 電(dian)位實驗中測量五次，如(ru)下所(suo)述。
2. Zeta 電(dian)位
通(tong)過電(dian)泳(yong)光(guang)散(san)射(she) (ELS) 測(ce)量(liang)的(de) Zeta 電(dian)位測(ce)量(liang)粒(li)子(zi)在(zai)電(dian)泳(yong)場(chang)中的速度(du)。Zeta 電(dian)位是(shi)膠體分散(san)體穩定(ding)性的(de)指標（絕(jue)對值）和囊泡(pao)表面電(dian)荷的量(liang)度(du)（+ 或(huo) - 符(fu)號(hao)）。
3.電(dian)子(zi)顯(xian)微鏡(jing)分析
對(dui)於(yu)電(dian)子(zi)顯(xian)微鏡(jing)分析，外泌體制(zhi)劑(ji)在 PBS 緩(huan)沖液中按(an) 1:10 稀釋，隨後在(zai)等體積的 4% (w/v) 多(duo)聚(ju)甲(jia)醛(quan)和 1% (v/v) 戊(wu)二(er)醛(quan)中固定 5 分鐘(zhong)。然(ran)後(hou)將樣品置(zhi)於(yu) formvar-carbon 塗層(ceng)的 600 目(mu)銅(tong)網格上(shang)，並在(zai)室溫(wen)下幹(gan)燥 5 分(fen)鐘(zhong)。隨後將樣品在乙(yi)酸雙氧鈾溶液（2% 水(shui)溶液）中進行(xing)對比，並在(zai)電(dian)子(zi)顯(xian)微鏡(jing)（Jeol1230 TEM）下觀(guan)察，加(jia)速電(dian)壓為(wei) 80 kV，並連接到數碼(ma)相(xiang)機進行(xing)觀察 .

三(san)、Bradford 分(fen)析法(fa)測(ce)定樣品中的蛋白質(zhi)含量(liang)
為了(le)量(liang)化培(pei)養(yang)第 3 天(tian)和第 5 天(tian)的 CHO 細胞沈(chen)澱(dian)物(wu)和外來體制(zhi)劑(ji)中的蛋白質(zhi)含量(liang)，對細(xi)胞裂解物以(yi)及外來體裂解物和(he) 75 μl 等分(fen)試樣（每份均來(lai)自 1 ml 培養(yang)物）進行(xing) Bradford 測定非裂解外泌體 。通(tong)過向(xiang)細胞(bao)或(huo)外泌體制(zhi)劑(ji)中添加(jia)先(xian)前(qian)描述(shu)的(de)裂解緩(huan)沖液來(lai)制(zhi)備裂(lie)解物。
1.SDS-PAGE 和(he)蛋白質(zhi)印跡
對裂解和未(wei)裂解的外泌體制(zhi)劑(ji)以及分(fen)批培(pei)養第 3 天(tian)和第 5 天(tian)的細胞裂解物進行(xing)蛋白質(zhi)印跡。所有樣品均在(zai)還原(yuan)（含(han)有 β-巰基乙(yi)醇）或(huo)非還原(yuan) Laemmli 樣品緩(huan)沖液中制(zhi)備，在(zai) 95 °C 下煮(zhu)沸(fei) 5 分(fen)鐘，隨後如(ru)前(qian)所(suo)述通(tong)過 12% SDS-PAGE 分離(li)。每個蛋(dan)白質(zhi)樣品上(shang)樣約 5 g。以(yi)下壹(yi)抗用(yong)於(yu)已知外泌體標記物的蛋(dan)白質(zhi)印跡；抗 CD63（Santa Cruz，sc-5275）、抗 CD81（Santa Cruz，sc-166029 和 sc-23962）和(he)抗 TSG101（Santa Cruz，sc-136111）。
3. RNA分離(li)和分析
從(cong)收獲的第 3 天(tian)和第 5 天(tian)的 3 個外泌體樣本中提取(qu)總 RNA。根(gen)據制(zhi)造商的說明，使用(yong)總外泌體 RNA (TER) 和蛋白質(zhi)分離(li)試劑(ji)盒（Invitrogen）提取(qu) RNA。從(cong)源(yuan)自 1 ml 培養(yang)物的(de)每(mei)個(ge)外泌體樣品中洗脫出 30-35 μl RNA。然(ran)後(hou)使用(yong) NanoDrop ND-1000 分(fen)光光(guang)度(du)計(ji)估(gu)計(ji)回(hui)收(shou)的(de) RNA 總量。
4.脂(zhi)質(zhi)分析
從(cong) (a) 總細胞(bao)沈(chen)澱(dian)中提取(qu)脂(zhi)質(zhi)（1 × 10 ⁶個活(huo)細胞(bao)，在第 3 天(tian)收獲時(shi)含(han)有 298.9 g 蛋白質(zhi)，在第 5 天(tian)收獲時(shi)含(han)有 477.2 g 蛋白質(zhi)），儲(chu)存(cun)在(zai) - 80 °C，和(he)（ b) 從 7 × 1 ml 培(pei)養物中分離(li)出的合(he)並(bing)外泌體（即我們(men)在(zai)每個(ge)時(shi)間(jian)點從(cong) 1 ml 培(pei)養物中分離(li)出 7 × 75 μl 等分(fen)試樣，然(ran)後(hou)將它們合(he)並(bing)在壹(yi)起(qi)）. 然(ran)後(hou)通(tong)過向(xiang)細胞(bao)/外泌體制(zhi)劑(ji)中加(jia)入(ru)氯仿：甲醇 (2:1) 溶(rong)液 (3 ml)，從(cong)這(zhe)些樣品中提取(qu)脂(zhi)質(zhi)進行(xing)分析。
     蘇(su)州阿(e)爾法(fa)生(sheng)物提供(gong)的生(sheng)物(wu)反應(ying)器(qi)、PCR儀、振蕩培養(yang)箱(xiang)、離(li)心機、細胞(bao)計(ji)數儀、細胞(bao)分(fen)析儀(yi)、電(dian)泳(yong)儀(yi)、粒(li)徑分析儀(yi)、流式細(xi)胞(bao)儀等廣(guang)泛用(yong)於(yu)細胞(bao)外囊泡(pao)的(de)分離(li)和表征(zheng)研(yan)究等。