實時定(ding)量PCR技(ji)術(shu)中常(chang)見問題匯(hui)總
實時定(ding)量PCR技(ji)術(shu)（real-time PCR）也(ye)叫(jiao)qPCR（Quantitave PCR），是指(zhi)在PCR反應體系中(zhong)加入熒(ying)光(guang)基(ji)團，利用熒(ying)光(guang)信(xin)號累(lei)積實時監(jian)測整(zheng)個(ge)PCR進(jin)程，最(zui)後通(tong)過特(te)定數學(xue)原(yuan)理對未(wei)知模板進(jin)行定(ding)量分析(xi)的(de)方(fang)法(fa)。它(ta)是壹(yi)項(xiang)臨床(chuang)上(shang)非(fei)常(chang)成(cheng)熟的(de)技(ji)術(shu)，目(mu)前在分子(zi)生物(wu)學領(ling)域，qPCR核(he)酸定量的(de)主要方(fang)法(fa)。目(mu)前仍在全球肆虐的(de)病(bing)毒鑒(jian)定(ding)的(de)“金(jin)標準"——核(he)酸檢(jian)測就是通(tong)過qPCR原(yuan)理進行的(de)。
那(na)麽(me)拿(na)到(dao)壹(yi)個(ge)樣(yang)本(ben)，需要(yao)經過(guo)以下(xia)多(duo)項(xiang)操(cao)作流程才(cai)能定(ding)量檢(jian)測到(dao)它(ta)的(de)核(he)酸含(han)量。其中任(ren)何壹個步驟(zhou)操(cao)作失誤(wu)都會導(dao)致(zhi)它(ta)的(de)檢(jian)測結(jie)果(guo)出現異常(chang)！
1、無Ct值(zhi)出現
a) 檢(jian)測熒(ying)光(guang)信(xin)號的(de)步驟(zhou)有誤(wu)：壹般染料(liao)法(fa)采(cai)用72℃延伸時采(cai)集，探針法(fa)則(ze)壹(yi)般在退火結(jie)束(shu)時(shi)或(huo)延(yan)伸結(jie)束(shu)采(cai)集信號。
b) 引(yin)物(wu)或(huo)探(tan)針降解：可(ke)通(tong)過PAGE電(dian)泳檢(jian)測其完(wan)整性。
c) 模板量不(bu)足(zu)：對未(wei)知濃(nong)度(du)的(de)樣(yang)品(pin)應從(cong)系(xi)列稀釋樣(yang)本(ben)的(de)最(zui)高濃度做(zuo)起。
d) 模板降(jiang)解：避免(mian)樣品(pin)制(zhi)備(bei)中雜(za)質(zhi)的(de)引(yin)入及(ji)反復(fu)凍(dong)融(rong)的(de)情(qing)況。
e) 反應循環(huan)數不(bu)夠：壹(yi)般都要(yao)在35個循環(huan)以上(shang)，可(ke)根(gen)據(ju)實驗情(qing)況增(zeng)加(jia)循環(huan)，但(dan)高於45個循環(huan)會增(zeng)加(jia)過(guo)多(duo)的(de)背(bei)景信(xin)號(hao)。
2、Ct值(zhi)出現過晚
a) 擴增(zeng)效(xiao)率(lv)極(ji)低：優化反應條件(jian)，嘗試三(san)步法(fa)擴(kuo)增(zeng)程序，或(huo)者(zhe)重(zhong)新設(she)計引(yin)物(wu)。
b) 模板濃(nong)度太低：減少(shao)稀(xi)釋度，重(zhong)復(fu)實驗。
c) 模板降(jiang)解：重(zhong)新制(zhi)備(bei)模板，重(zhong)復(fu)實驗。
d) PCR產物太長(chang)：壹(yi)般將PCR產物(wu)長(chang)度(du)設(she)計為(wei)100 bp-200 bp之間(jian)。
e) 反應體系中(zhong)存在PCR反應抑(yi)制(zhi)劑(ji)：壹般為(wei)加(jia)入模板時(shi)帶(dai)入，導(dao)致(zhi)模板質(zhi)量不(bu)高，加大模板稀(xi)釋倍數或(huo)者(zhe)重(zhong)新制(zhi)備(bei)模板重(zhong)復(fu)實驗。
3、陰性對照(zhao)出現明(ming)顯擴增(zeng)
a) 反(fan)應體系組分（如(ru)水(shui)）被汙染(ran)：實驗過程中(zhong)，更(geng)換新的(de)Mix或(huo)者(zhe)水(shui)重(zhong)復(fu)實驗。
b) 標本(ben)間(jian)的(de)交叉汙染(ran)或(huo)產(chan)物汙染(ran)：反(fan)應體系在超凈工作臺內(nei)配制(zhi)，對實驗室(shi)進(jin)行嚴(yan)格的(de)區(qu)分，減(jian)少(shao)氣(qi)溶(rong)膠汙染(ran)；使(shi)用帶(dai)濾(lv)芯的(de)槍(qiang)頭(tou)。
c) 引(yin)物(wu)二聚體的(de)出現：引(yin)物(wu)設計不(bu)夠優(you)化：應避(bi)免(mian)引(yin)物(wu)二聚體和(he)發夾(jia)結(jie)構(gou)的(de)出現。
d) 引(yin)物(wu)濃度不(bu)佳(jia)：適當(dang)降(jiang)低引(yin)物(wu)的(de)濃(nong)度(du)，並註(zhu)意(yi)上(shang)下(xia)遊引(yin)物(wu)的(de)濃(nong)度(du)配比。在35循環(huan)後陰(yin)性對照(zhao)出現擴增(zeng)屬(shu)正常(chang)情(qing)況，可(ke)配合(he)熔(rong)解(jie)曲(qu)線進(jin)行分析(xi)。
4、熔解(jie)曲(qu)線出現多(duo)峰
a) 非(fei)特異性擴(kuo)增(zeng)。
b) 引(yin)物(wu)設計不(bu)佳(jia)：避(bi)免(mian)二聚體和(he)發夾(jia)結(jie)構(gou)的(de)出現。
c) 引(yin)物(wu)濃度不(bu)佳(jia)：適當(dang)調整引(yin)物(wu)濃度。
d) 退火溫(wen)度低：提高退火溫(wen)度。
e) 模板中(zhong)有基因組DNA的(de)汙染(ran)：RNA提(ti)取過程中(zhong)避(bi)免(mian)基因組DNA的(de)汙染(ran)（DNaseI處(chu)理），或(huo)通(tong)過設(she)計引(yin)物(wu)避免(mian)非特(te)異性擴(kuo)增(zeng)。
5、出現引(yin)物(wu)二聚體
a) 優化擴增(zeng)條件(jian)，如提(ti)高退火溫(wen)度，可(ke)利(li)用(yong)梯(ti)度PCR，摸索(suo)最(zui)佳(jia)的(de)Tm值(zhi)。通(tong)常(chang)兩(liang)步循環(huan)(由(you)95℃變(bian)性步驟(zhou)直接(jie)進(jin)入60℃退火和(he)延(yan)伸步驟(zhou))有利(li)於(yu)強(qiang)效(xiao)擴(kuo)增(zeng)，因此引(yin)物(wu)設計時設(she)定的(de)成(cheng)功(gong)退火溫(wen)度為(wei)60°C。
b) 引(yin)物(wu)濃度太高，適當(dang)降(jiang)低引(yin)物(wu)濃度。
c) 可(ke)通(tong)過瓊(qiong)脂糖凝膠電(dian)泳確認引(yin)物(wu)二聚體。引(yin)物(wu)二聚體在凝膠的(de)底(di)部(bu)形(xing)成(cheng)擴散條帶(dai)，通(tong)常(chang)位於100 bp以下(xia)。
6、擴增(zeng)效(xiao)率(lv)低
a) 反應試劑(ji)中部(bu)分成(cheng)分特(te)別是熒(ying)光(guang)染(ran)料降解。
b) 反(fan)應條件(jian)不(bu)佳(jia)：適當(dang)降(jiang)低退火溫(wen)度或(huo)改為(wei)三(san)步擴(kuo)增(zeng)法(fa)。
c) 反(fan)應體系中(zhong)有抑(yi)制(zhi)物：壹(yi)般為(wei)模板中(zhong)引(yin)入，應先(xian)把(ba)模板適當(dang)稀(xi)釋，再加入到(dao)體系中(zhong)，減少(shao)抑(yi)制(zhi)物的(de)影(ying)響(xiang)。
7、實驗重(zhong)復(fu)性差(cha)
a) 加(jia)樣體積失準：使用(yong)性能較(jiao)好的(de)移(yi)液(ye)槍，擴大(da)反(fan)應體積，將模板做(zuo)高倍稀釋(shi)，以大(da)體積加入反(fan)應體系中(zhong)。
b) 定量PCR儀不(bu)同(tong)位置溫(wen)度控(kong)制(zhi)不(bu)壹(yi)致(zhi)：定期(qi)校準儀器。
c) 模板濃(nong)度太低：模板濃(nong)度越稀(xi)，重(zhong)復(fu)性越差(cha)，減(jian)少(shao)模板稀(xi)釋度或(huo)提(ti)高加樣體積。
d) qPCR mix沒有混(hun)勻，請使用(yong)前充分混(hun)勻。
蘇(su)州阿(e)爾(er)法(fa)生(sheng)物(wu)提(ti)供(gong)的(de)PCR儀系(xi)列(lie)主要有(you)A100基(ji)因擴增(zeng)儀、A200PCR儀、A300快(kuai)速(su)PCR儀、A600梯(ti)度(du)PCR儀、T20PCR儀、Q2000B高通(tong)量熒(ying)光(guang)定(ding)量PCR儀、便攜式(shi)PCR儀等(deng)。
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