使(shi)用生物反(fan)應器(qi)研究乳腺癌(ai)亞型細胞(bao)外囊(nang)泡(pao)產(chan)生(sheng)技(ji)術
更(geng)新時(shi)間(jian)：2023-02-02
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使(shi)用生物反(fan)應器(qi)研究乳腺癌(ai)亞型細胞(bao)外囊(nang)泡(pao)產(chan)生(sheng)技(ji)術
使(shi)用傳統體外方(fang)法生產(chan)的(de) EV 的(de)深(shen)入(ru)表(biao)征和驗(yan)證(zheng)由(you)於(yu)需要大面積(ji)的(de)細胞(bao)單(dan)層和(he)大(da)量的培(pei)養基(ji)，培(pei)養可(ke)能具有(you)挑戰(zhan)性。該(gai)實驗(yan)方(fang)法使(shi)用貼壁細胞(bao)生(sheng)物反(fan)應器(qi)系統以節省(sheng)空(kong)間(jian)、資(zi)源和時(shi)間(jian)的(de)方(fang)式(shi)同時(shi)培(pei)養多(duo)種(zhong)不(bu)同亞型(xing)的(de)乳(ru)腺癌(ai)細胞(bao)系，從而(er)能夠(gou)持(chi)續(xu)生(sheng)產(chan)大(da)量(liang)用於(yu)下遊(you)實(shi)驗(yan)的 EV。
壹(yi)、生物(wu)反(fan)應器(qi)接(jie)種(zhong)、適(shi)應和(he)維(wei)護
培(pei)養基(ji) A：含(han)有(you) 10% 胎牛(niu)血清（FBS，Merck）和(he) 1% 青黴素(su)/鏈黴(mei)素(su)（PS，Gibco）的 DMEM（Gibco）。
培(pei)養基(ji) B：Advanced DMEM/F-12(Gibco)、2% CDM-HD (Fibercell)、2% FBS、1% Glutamax (Gibco) 和 1% PS。
培(pei)養基(ji)C：高級 DMEM/F-12、2% CDM-HD、1% Glutamax (Gibco) 和 1% PS。
將(jiang)細胞(bao)密(mi)度培(pei)養為(wei)1.5 × 10 6 個細胞(bao)/ml 的(de) 15 mL細胞(bao)重(zhong)懸液接(jie)種(zhong)到(dao)貼壁生物(wu)反(fan)應器(qi)的(de)下部細胞(bao)室(shi)中（ Argos) 並(bing)在上(shang)層培(pei)養基(ji)室(shi)中加(jia)入(ru) 500 ml 相同培(pei)養基(ji). 通過(guo)用培(pei)養基(ji) A 代(dai)替(ti)培(pei)養基(ji) C，細胞(bao)逐漸適(shi)應 CDM-HD 血清替(ti)代(dai)品(pin)（Fibercell Systems）和高級 DMEM/F12（以盡(jin)量減少 FBS 的使(shi)用）。細胞(bao)室(shi)每 3-4 天(tian)更新壹(yi)次(ci)，培(pei)養基(ji)室(shi)更新壹(yi)次(ci)每(mei)周。1 周後(hou)，培(pei)養基(ji)更改(gai)為(wei) 75%培(pei)養基(ji)A 和 25%培(pei)養基(ji)B。接(jie)下來的壹周更(geng)改(gai)為(wei) 50% 培(pei)養基(ji) A 和 50%培(pei)養基(ji)B，然(ran)後(hou)下壹周更(geng)改(gai)為(wei) 25% 培(pei)養基(ji) A 和 75%培(pei)養基(ji) B。最(zui)後(hou)，在第(di) 4 周，細胞(bao)室(shi)用 15 ml 預熱的 PBS 仔(zai)細清(qing)洗(xi) 3 次(ci)以(yi)去除(chu)任(ren)何殘留的 FBS EV，並填充(chong) 15 ml 培(pei)養基(ji) C，同時(shi)培(pei)養基(ji)室(shi)保持(chi) 500 ml 培(pei)養基(ji) B。
適(shi)應後(hou)，從細胞(bao)室(shi)收(shou)集 15 ml 條件培(pei)養基(ji)用於(yu) EV 分離，並每 3-4 天(tian)（星(xing)期壹(yi)和(he)星(xing)期四）更新壹(yi)次(ci)，而(er)細胞(bao)室(shi)每 7 天(tian)（星(xing)期四）更換壹次(ci)。每(mei)次(ci)更(geng)換時(shi)記錄(lu)細胞(bao)室(shi)培(pei)養基(ji)體積(ji)（ml）。通(tong)過(guo)將(jiang) 10 μl 的(de)
條件培(pei)養基(ji)與(yu) 1:1 臺盼(pan)藍混(hun)合並(bing)在細胞(bao)計數(shu)儀上(shang)進行(xing)觀察(cha)和(he)計數(shu)，將其(qi)用於(yu)懸浮(fu)細胞(bao)的(de)定量。數(shu)字以(yi)“EV Collection #"表(biao)示，其中(zhong) EV Collection #1 對(dui)應於(yu)接(jie)種(zhong)後(hou) 28 天，此(ci)後(hou)每周進行(xing)兩次(ci)收(shou)集。二(er)、常(chang)規(gui)培(pei)養物(wu)比(bi)較BT-474 和 MDA-MB-231 細胞(bao)在 2D 燒(shao)瓶(ping)中進行(xing)血清饑餓培(pei)養，以(yi)將 EV 產(chan)量(liang)與(yu)生物(wu)反(fan)應器(qi)培(pei)養物(wu)進行(xing)比(bi)較。簡而(er)言之，細胞(bao)在標(biao)準(zhun)條件下在含(han)有(you) 10% FBS 和 1% P/S 的(de) DMEM 中培(pei)養，並(bing)通過(guo)使(shi)用 TrypLE (Gibco) 在其(qi)生(sheng)長期（~80% 匯合度(du)）分裂和重新接(jie)種(zhong)，將(jiang)每(mei)個(ge)培(pei)養瓶(ping)增至(zhi) 9× T175 燒瓶(ping). 將 9 × T175 燒(shao)瓶(ping)接(jie)種(zhong)在含(han)血清培(pei)養基(ji)中，達(da)到(dao)約 30% 的匯合度(du)，壹旦(dan)細胞(bao)達(da)到(dao)約 60% 的匯合度(du)，就(jiu)用 PBS 洗(xi)滌 3 次(ci)以(yi)去除(chu)任(ren)何殘留的外源性 FBS EV，並(bing)在 50 ml DMEM 中(zhong)加(jia)入(ru) 1將 % P/S 添加(jia)到(dao)每個燒瓶(ping)中(zhong)。48 小時(shi)後(hou)，收(shou)集條件培(pei)養基(ji)並以(yi) 2000× g離(li)心10 分鐘，然(ran)後(hou)使(shi)用 Vivaspin 50、100 kDa 濃縮(suo)器(qi)濃縮(suo)，將(jiang)培(pei)養基(ji)體積(ji)從(cong) 450 毫升(sheng)減少到(dao) 40 毫升(sheng)。使(shi)用尺寸排(pai)阻(zu)色(se)譜法（SEC）對來(lai)自這(zhe)種(zhong)濃縮(suo)條件培(pei)養基(ji)的 EV 進行(xing)超(chao)速(su)離(li)心和(he)純化。在接(jie)種(zhong)前(qian)，使(shi)用支原體(ti)染(ran)色(se)試劑盒 (Sigma-Aldrich) 對(dui)常(chang)規(gui)細胞(bao)培(pei)養物(wu)和在生(sheng)物(wu)反(fan)應器(qi)中(zhong)生長的培(pei)養物(wu)進行(xing)支原體(ti)檢(jian)測(ce)。
生物反(fan)應器(qi)實(shi)驗和(he)維(wei)護(hu)示(shi)意(yi)圖(tu)。(a) 雙(shuang)室(shi) CELLine AD 1000 生物(wu)反(fan)應器(qi)圖(tu)和用於(yu)分離和表(biao)征 EV 的工藝(yi)流(liu)程(cheng)； (b) 生物(wu)反(fan)應器(qi)維(wei)護方(fang)法顯示(shi)在接(jie)種(zhong)和(he)培(pei)養基(ji)適(shi)應（4 周）後(hou)每周收(shou)集兩次(ci) EV，每(mei)周更(geng)新壹(yi)次(ci)培(pei)養基(ji)室(shi)；(c) 解構(gou)後(hou)對生(sheng)物反(fan)應器(qi)生(sheng)長表(biao)面進行(xing)成(cheng)像的(de)方(fang)法，包(bao)括(kuo) SEM 和 H&E 。三(san)、外泌(mi)體(ti) EV隔(ge)離(li) 將來(lai)自生物反(fan)應器(qi)細胞(bao)室(shi)的 15 ml 條件培(pei)養基(ji)以 2000 × g離(li)心10 分鐘以去除(chu)細胞(bao)和(he)其他碎(sui)片。然(ran)後(hou)按照制造商(shang)的(de)說明使(shi)用高速(su)離(li)心機(ji)將(jiang)上(shang)清(qing)液與(yu) PBS 混(hun)合以(yi)達到(dao)小體積(ji)的(de) 20 ml，以 10,000 x g離心30 分鐘以沈(chen)澱(dian)大型 EV（也(ye)稱為微(wei)泡(pao)）和該(gai)顆粒(li)重(zhong)新懸(xuan)浮(fu)在 500 μl PBS 中(zhong)並(bing)儲存(cun)。然(ran)後(hou)將上(shang)清(qing)液以 100,000 x g超(chao)速(su)離(li)心70 分鐘以產(chan)生(sheng)粗(cu)制小 EV 顆粒(li)。將(jiang)該(gai)沈(chen)澱(dian)重懸於(yu) 700 μl PBS 中並(bing)儲存在 -80°C 直至(zhi)需要，盡量(liang)減少冷凍(dong)解凍(dong)的次(ci)數(shu)。 將 500 μl 粗小型(xing) EV 加(jia)載(zai)到(dao) 35 nm qEV Original SEC 柱上(shang)，並(bing)使(shi)用自動餾(liu)分收(shou)集器（每(mei)個餾(liu)分 500 μl）收(shou)集餾(liu)分 7 至(zhi) 23。對每(mei)個收(shou)集的級分進行(xing)高靈(ling)敏度(du) BCA 測(ce)定（Pierce，ThermoFisher Scientific）以確定它們的蛋白質(zhi)濃度。壹(yi)旦確定了富含(han) EV 的(de)分數，只有(you)那些富含(han) EV 的(de)分數（由(you) NTA 填(tian)充(chong)的顆粒(li)；F8-F10）被(bei)收(shou)集並匯集在隨(sui)後(hou)的分離中。 四、納(na)米(mi)粒(li)子追蹤(zong)分析 在 PBS 中(zhong)以(yi) 1:100 的比(bi)例稀(xi)釋 SEC 純化的(de)小(xiao)型 EV 個體和(he)合並(bing)的級分，並使(shi)用 NS300 Nanosight（Malvern Analytical）或(huo)Nanocoulter Ⅰ進行(xing)測(ce)量。在低流(liu)量(liang)條件下進行(xing)表(biao)征分析，如：平(ping)均和眾(zhong)數粒(li)徑、濃度、電(dian)位和(he)尺寸分布(bu)。匯集了富含(han) EV 的(de)部分，並用於(yu)跟蹤(zong) EV 生產(chan)、TEM 和(he)質(zhi)譜分析。使(shi)用 Kruskal-Wallis 檢(jian)驗(yan)在 Graphpad Prism 中(zhong)對(dui)每個(ge)細胞(bao)系的 EV 產(chan)量(liang)和(he) EV 相(xiang)關蛋白進行(xing)統計比(bi)較（P < 0.05) 在包(bao)括(kuo) Kolmogorov–Smirnov 和 Shapiro–Wilk 測(ce)試在內的正(zheng)態(tai)性測(ce)試呈陰(yin)性後(hou)。平(ping)均值(zhi)以±標(biao)準(zhun)偏差(cha)報告。散(san)點(dian)圖(tu)以平(ping)均值(zhi)和標(biao)準(zhun)偏差(cha)呈(cheng)現。五(wu)、透射電(dian)鏡(jing)分析通過(guo)吸附(fu)到(dao) Formvar 塗(tu)層銅(tong)網(wang)格（電(dian)子顯(xian)微鏡(jing)科(ke)學）上(shang) 10 分鐘，對小型(xing) EV 進行(xing)負染(ran)色(se) TEM。用濾紙(zhi)（Whatman）去除(chu)多(duo)余(yu)的液(ye)體，然(ran)後(hou)將銅(tong)網(wang)格轉(zhuan)移到(dao) 20 μl 已(yi)過(guo)濾的 2% 乙(yi)酸(suan)雙(shuang)氧(yang)鈾(you)中 2 分鐘。用濾紙(zhi)除(chu)去多余(yu)的液(ye)體，讓(rang)網(wang)格幹(gan)燥 10 分鐘。網(wang)格在 TEM 上(shang)以(yi) 120 kV 加速(su)電(dian)壓(ya)可(ke)視(shi)化，並(bing)拍攝(she)圖(tu)像。六(liu)、 免(mian)疫(yi)印跡(ji) 合並(bing)的小(xiao)型 EV 以 100,000 × g超(chao)速(su)離(li)心濃縮(suo)70 分鐘，並通過(guo) BCA 測(ce)量蛋白質(zhi)水平(ping)。通(tong)過(guo) SDS-聚(ju)丙(bing)烯(xi)酰胺(an)凝(ning)膠(jiao)電泳分離等(deng)量(liang)（4 μg/泳道）的 SEC 純化的(de)小(xiao)型 EV 和細胞(bao)裂(lie)解物，並(bing)轉移(yi)至(zhi) PVDF 膜（ Millipore) 。為(wei)防止非(fei)特(te)異性結(jie)合，將(jiang)膜與(yu)封閉溶(rong)液(ye)壹(yi)起(qi)孵(fu)育(yu)使(shi)用 Pierce ECL Western Blotting Substrate (ThermoFisher Scientific) 使(shi)結(jie)合的(de)抗體(ti)可視化，並(bing)使(shi)用化學(xue)發(fa)光(guang)凝(ning)膠(jiao)成(cheng)像系統進行(xing)分析。七(qi)、無(wu)標(biao)記蛋白質(zhi)組學分析（SWATH-MS） 將EV 在真(zhen)空(kong)濃縮(suo)器(qi)（中濃縮(suo)至(zhi) 150 μl 的體(ti)積(ji)。加(jia)入(ru) 150 μl 7 M 尿(niao)素(su)、2 M 硫(liu)脲(niao)、5 mM DTT、0.1% SurfactAmps X-100 的(de) 50 mM 碳酸氫銨溶液(ye)後(hou)，將樣(yang)品(pin)在聲(sheng)波(bo)浴(yu)中(zhong)超(chao)聲(sheng)處(chu)理(li) 15 分鐘。通過(guo)在 56°C 的(de)加(jia)熱塊中孵(fu)育(yu) 20 分鐘來減少二(er)硫(liu)鍵(jian)。 而(er)後(hou)樣(yang)本(ben)處(chu)理(li)後(hou)進行(xing)SWATH 分析。 蘇州(zhou)阿爾(er)法生物(wu)專註於(yu)實驗(yan)室(shi)儀器(qi)設備和實(shi)驗器材供應14年(nian)，提供的實驗(yan)設備包(bao)括(kuo)：生物(wu)反(fan)應器(qi)、PCR儀(yi)、振(zhen)蕩(dang)培(pei)養箱(xiang)、高速(su)離(li)心機(ji)、細胞(bao)計數(shu)儀、凝(ning)膠(jiao)成(cheng)像儀(yi)、電泳儀(yi)、粒(li)徑分析儀、流(liu)式(shi)細胞(bao)儀(yi)、顯微鏡(jing)等(deng)廣(guang)泛用於(yu)EV分析和外囊(nang)泡(pao)的(de)表(biao)征研究等(deng)。
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