層析工(gong)藝放(fang)大(da)需(xu)要遵循(xun)的原則

層析工(gong)藝放(fang)大(da)原則包(bao)括(kuo)線(xian)性放(fang)大(da)原則和(he)固(gu)定(ding)保留時間(jian)原則。

線(xian)性放(fang)大(da)原則

線(xian)性放(fang)大(da)原則是工(gong)藝放(fang)大(da)過程中常(chang)用的原則，其(qi)核(he)心思路是保持(chi)層析柱(zhu)柱(zhu)高(gao)和(he)線(xian)性流(liu)速(su)不(bu)變(bian)，只(zhi)放大(da)層析柱(zhu)直徑和體積流速(su)。固(gu)定(ding)的柱(zhu)高(gao)和(he)線(xian)性流(liu)速(su)理(li)論(lun)上(shang)可(ke)以(yi)保證(zheng)相(xiang)同(tong)的保留時間(jian)、層析中(zhong)溶(rong)液用(yong)到(dao)的CV數(shu)和(he)洗脫(tuo)樣品(pin)CV數(shu)，較(jiao)大(da)程度保證(zheng)相(xiang)同(tong)的純化(hua)效果(guo)。

線(xian)性放(fang)大(da)原則的具體(ti)操(cao)作(zuo)方(fang)法可參(can)見(jian)下(xia)表：

層析工(gong)藝

在(zai)實際(ji)的應用(yong)過程中，線(xian)性放(fang)大(da)可能(neng)會遇(yu)到(dao)幾(ji)個(ge)問題，壹(yi)是層析設(she)備供應(ying)商(shang)提供的層析柱(zhu)都是幾(ji)個(ge)固(gu)定(ding)規(gui)格(ge)，可能無法適(shi)配具(ju)體(ti)某(mou)項的工(gong)藝需(xu)求(qiu)；二(er)是當層析柱(zhu)直徑超過30cm時，由(you)於(yu)柱(zhu)壁支撐(cheng)效(xiao)應(ying)的降低(di)，通(tong)常(chang)會造成(cheng)層析填(tian)料的過度(du)壓縮(suo)，從而導(dao)致反(fan)壓(ya)增(zeng)大(da)，小(xiao)試(shi)規(gui)模(mo)優(you)化(hua)設(she)計(ji)的線(xian)性流(liu)速(su)則(ze)有可(ke)能無法實現(xian)。此(ci)時(shi)，可(ke)以(yi)考慮固(gu)定(ding)保留時間(jian)原則。

固(gu)定(ding)保留時間(jian)原則

固(gu)定(ding)保留時間(jian)原則只(zhi)要求保持(chi)層析工(gong)藝的保留時間(jian)不(bu)變(bian)，層析柱(zhu)柱(zhu)高(gao)和(he)線(xian)性流(liu)速(su)則(ze)可以(yi)同(tong)時改變(bian)。這樣層析柱(zhu)的選擇就會更加靈(ling)活(huo)。壹(yi)般(ban)的蛋白(bai)純化(hua)，如(ru)親(qin)和(he)層析、疏(shu)水層析和(he)離子交(jiao)換(huan)層析的結(jie)合/洗(xi)脫(tuo)模(mo)式，都有成(cheng)功(gong)應(ying)用固定(ding)保留時間(jian)原則進行放大(da)工(gong)藝的開發(fa)的案(an)例(li)，這樣可以避(bi)免(mian)珍貴(gui)樣品(pin)、層析填(tian)料的浪費，有效(xiao)降低(di)生產(chan)成(cheng)本。

當然，固定(ding)保留時間(jian)原則也(ye)具(ju)有壹(yi)定(ding)的局限性，對於(yu)壹(yi)些對(dui)流(liu)擴散(san)主(zhu)導(dao)的層析，也(ye)就是層析純(chun)化依賴於(yu)理(li)論(lun)塔(ta)板(ban)數(shu)的層析方(fang)法，如(ru)凝膠(jiao)過濾(lv)層析，層析線(xian)性流(liu)速(su)對(dui)於(yu)分(fen)離效果(guo)具(ju)有顯著(zhu)影(ying)響(xiang)，則不(bu)適(shi)用(yong)於(yu)固定(ding)保留時間(jian)原則。多(duo)模(mo)式的層析通(tong)常(chang)也(ye)不(bu)適(shi)用(yong)固(gu)定(ding)保留時間(jian)原則。

層析工(gong)藝需(xu)要確認(ren)的因素

層析系(xi)統(tong)

與小(xiao)試(shi)所用(yong)的層析系(xi)統(tong)相(xiang)比，商(shang)業化(hua)生產(chan)用層析系(xi)統(tong)需(xu)要考慮(lv)：

1.系(xi)統(tong)管路的死體(ti)積。大(da)規(gui)模(mo)生產(chan)用層析系(xi)統(tong)往往(wang)具(ju)有較(jiao)大(da)的死體(ti)積，層析過(guo)程會造成(cheng)樣品(pin)的擴散(san)，從而影(ying)響(xiang)洗脫(tuo)收集(ji)體(ti)積和分(fen)離分(fen)辨率(lv)。

2.紫外流通(tong)池長(chang)度(du)。紫外流通(tong)池的長度(du)變(bian)化會造成(cheng)蛋白吸收(shou)峰高(gao)的變(bian)化，從而影(ying)響(xiang)洗脫(tuo)峰的起(qi)收點和(he)停收點。

3.泵的設(she)計(ji)。泵的設(she)計(ji)會帶(dai)來(lai)不(bu)同(tong)的剪切(qie)力，對產(chan)品(pin)的穩定(ding)性帶(dai)來(lai)影響(xiang)。同(tong)時，泵的精度(du)還會影(ying)響(xiang)緩(huan)沖(chong)液及(ji)樣品(pin)體(ti)積的控(kong)制。

4.混合效(xiao)果(guo)。如(ru)果使(shi)用雙泵進行線(xian)性洗(xi)脫(tuo)，雙泵緩(huan)沖(chong)液的混合則(ze)會影(ying)響(xiang)最終(zhong)的洗脫(tuo)效果(guo)。

層析柱(zhu)

層析柱(zhu)的選擇需(xu)要考慮(lv)的因素有：

1.層析柱(zhu)的尺寸(cun)和(he)材質。層析柱(zhu)的尺寸(cun)可(ke)以(yi)根據上(shang)文(wen)規(gui)模(mo)放(fang)大(da)的幾(ji)項原則來(lai)確定(ding)。層析柱(zhu)常用的材質有玻璃、丙烯酸(suan)和(he)不(bu)銹(xiu)鋼，使(shi)用不(bu)同(tong)材質的層析柱(zhu)需(xu)要考慮(lv)其溶(rong)出(chu)物/浸出(chu)物(wu)，以及對(dui)層析填(tian)料清(qing)潔(jie)試(shi)劑的耐受(shou)性(xing)。

2.層析柱(zhu)與層析系(xi)統(tong)和層析填(tian)料的匹(pi)配性(xing)

3.層析柱(zhu)操(cao)作(zuo)的難(nan)易程度。 隨(sui)著(zhe)層析柱(zhu)直徑的增加，層析柱(zhu)的裝填也(ye)變(bian)困難(nan)。通(tong)常(chang)的解(jie)釋(shi)是隨著(zhe)柱(zhu)直徑的增加，填(tian)料(liao)的柱(zhu)壁支撐(cheng)效(xiao)應(ying)減(jian)少(shao)，造成(cheng)反(fan)壓(ya)升(sheng)高(gao)，柱(zhu)床不(bu)穩定(ding)性增(zeng)加，從而影(ying)響(xiang)分(fen)離效果(guo)。此(ci)外，采(cai)用可(ke)自動(dong)化裝柱(zhu)的層析柱(zhu)，可有效(xiao)增加層析柱(zhu)放大(da)的成(cheng)功(gong)率(lv)。

層析填(tian)料

在小(xiao)試(shi)規(gui)模(mo)的工(gong)藝開(kai)發(fa)階(jie)段(duan)，通(tong)常(chang)會對(dui)層析填(tian)料的結(jie)合載量(liang)、配基(ji)脫(tuo)落量(liang)等基(ji)礎(chu)性(xing)能(neng)進行嚴格(ge)篩(shai)選，但是中試(shi)及生產(chan)規(gui)模(mo)的工(gong)藝往(wang)往會暴露層析填(tian)料壹(yi)些容易被忽(hu)視的問題。例(li)如(ru)上(shang)文(wen)提(ti)及(ji)的柱(zhu)壁支撐(cheng)效(xiao)應(ying)減(jian)少(shao)，造成(cheng)反(fan)壓(ya)升(sheng)高(gao)的問題，在小(xiao)試(shi)階段(duan)就(jiu)極(ji)難(nan)被(bei)發(fa)現(xian)。

非(fei)層析因(yin)素

在層析工(gong)藝的放大(da)過程中，還(hai)需(xu)要考慮(lv)和確(que)認(ren)壹(yi)些非(fei)層析因(yin)素：

上(shang)遊(you)培養(yang)來(lai)料

緩(huan)沖(chong)液的配制方(fang)法及儲(chu)存

中間(jian)品(pin)的處(chu)理(li)及(ji)保存時間(jian)

操(cao)作(zuo)溫(wen)度

  蘇州阿爾法生物提供層析系(xi)統(tong)填料(liao)包(bao)括(kuo) 瓊脂糖凝(ning)膠(jiao)過(guo)濾(lv)基質填料(liao)、組(zu)氨(an)酸(suan)標簽(qian)蛋(dan)白(bai)分(fen)離層析親(qin)和(he)蛋白純化(hua)介(jie)質等用(yong)於(yu)蛋白(bai)純化、蛋白質分(fen)離等。