熒光定量PCR實驗中(zhong)PCR儀(yi)器(qi)選購(gou)技(ji)巧

聚合酶鏈反應(ying) (PCR) 技(ji)術(shu)是無(wu)數研(yan)究和測試(shi)實驗室(shi)的(de)主(zhu)要(yao)技(ji)術(shu)，涉及(ji)的(de)領(ling)域(yu)包括生(sheng)物(wu)醫(yi)學(xue)、基因編(bian)輯(ji)、食品(pin)微(wei)生物學(xue)測試(shi) 等。熒光定量PCR技(ji)術(shu)使用(yong)熱循環來促進(jin)壹系列(lie)反應(ying)，在這些(xie)反應(ying)中(zhong)，DNA 樣本會快(kuai)速(su)、呈(cheng)指數地(di)復(fu)制(zhi)，從(cong)而(er)產生數百(bai)萬(wan)或(huo)數十(shi)億(yi)個(ge)序列(lie)拷貝。購(gou)買(mai)PCR儀(yi)器(qi)時(shi)，重要(yao)的(de)是要考慮(lv)您的(de)應(ying)用的(de)最終(zhong)目標(biao)、熱循環設備的(de)準(zhun)確(que)性(xing)和效(xiao)率(lv)以及(ji)儀(yi)器(qi)的(de)容量(liang)和靈(ling)活性(xing)。本文概述(shu)了 PCR儀(yi)器(qi)可用(yong)的(de)不(bu)同選項(xiang)和功(gong)能，以(yi)幫(bang)助(zhu)您選(xuan)購(gou)合(he)適的(de)PCR儀(yi) 。

1. PCR 與(yu) qPCR 與 dPCR

雖然所(suo)有(you) PCR 系(xi)統都使用(yong)聚合酶鏈式反應(ying)復(fu)制(zhi) DNA，但(dan)不(bu)同的(de)系(xi)統(tong)使用(yong)不(bu)同的(de)方法(fa)來獲(huo)得(de)特定的(de)結(jie)果。這些(xie)不(bu)同的(de)方法(fa)包括標(biao)準(zhun) PCR、定量 PCR (qPCR) 和數字 PCR (dPCR)。

標(biao)準(zhun) PCR 儀(yi)器(qi)通常(chang)用(yong)於(yu)擴(kuo)增(zeng) DNA 以供進(jin)壹步(bu)下遊(you)測試(shi)和使用(yong)；從(cong)某種意(yi)義(yi)上(shang)說，這項(xiang)技(ji)術(shu)被用作生(sheng)成(cheng)產品的(de)壹種手(shou)段(duan)，而(er)不是作為壹種分(fen)析(xi)測試(shi)方法(fa)本身。擴(kuo)增(zeng)的(de) DNA 只能在(zai) PCR 反應(ying)完成後(hou)進行(xing)測量(liang)，而(er)不(bu)是實時(shi)測量(liang)，因(yin)此(ci)這種方法(fa)有時(shi)被稱(cheng)為終(zhong)點(dian) PCR。傳統(tong) PCR 擴(kuo)增(zeng)的(de)最終(zhong)產物通(tong)常用(yong)於(yu)下遊(you)克(ke)隆和測序(xu)，也可以使用(yong)凝膠(jiao)電(dian)泳進(jin)行(xing)檢(jian)查(zha)，以在(zai)低分(fen)辨率(lv)（基於(yu)條(tiao)帶(dai)強(qiang)度(du)）下確認目標(biao)序(xu)列(lie)的(de)存(cun)在及(ji)其相(xiang)對數量(liang)。

為了更快(kuai)速(su)、更準(zhun)確(que)地定量樣品(pin)中(zhong)存(cun)在的(de)目(mu)標(biao)序(xu)列(lie)的(de)數量(liang)，定量 PCR (qPCR)，也稱(cheng)為實時(shi) PCR，在擴(kuo)增(zeng)過程(cheng)中(zhong)使用(yong)熒(ying)光探(tan)針(zhen)來監(jian)測每(mei)個(ge)熱循環後(hou)存(cun)在的(de) DNA 數量(liang)。通(tong)過觀察(cha)需(xu)要(yao)多(duo)少(shao)個(ge)循環(huan)才能達(da)到(dao)特定的(de)熒(ying)光強(qiang)度(du)閾值(zhi)，分(fen)析(xi)人員(yuan)可(ke)以在(zai)將結(jie)果與標(biao)準(zhun)曲線(xian)進行(xing)比較(jiao)時(shi)確定起始材料(liao)中(zhong)的(de) DNA 量(liang)。 qPCR 還可(ke)以(yi)比普通(tong) PCR 更快(kuai)地(di)確認目(mu)標(biao)序(xu)列(lie)的(de)存(cun)在或(huo)不(bu)存(cun)在，例(li)如(ru) SARS-CoV-2 的(de)檢(jian)測（使用(yong)逆轉(zhuan)錄(lu)首(shou)先(xian)將病(bing)毒(du) RNA 轉(zhuan)化(hua)為 cDNA） .

數字 PCR (dPCR) 是另(ling)壹種定量方法(fa)，其中(zhong) PCR 反應(ying)在數千(qian)個(ge)獨立的(de)反應(ying)室(shi)中(zhong)進(jin)行(xing)，原(yuan)始樣品(pin)中(zhong) DNA 分(fen)子的(de)絕(jue)對數量(liang)可(ke)以根據(ju)擴(kuo)增(zeng)完成後(hou)有多(duo)少反應(ying)室(shi)產生熒(ying)光信(xin)號(hao)來確(que)定. 與 qPCR 不(bu)同，熒光測量(liang)不(bu)是實時(shi)進行(xing)的(de)，也不需要標(biao)準(zhun)曲線(xian)來量(liang)化樣品(pin)中(zhong)的(de) DNA。雖(sui)然(ran) dPCR 通(tong)常(chang)具有有限的(de)通(tong)量(liang)和比 qPCR 更高(gao)的(de)成(cheng)本，但(dan)它(ta)在量(liang)化(hua) DNA 方面(mian)更加(jia)精(jing)確(que)、靈(ling)敏和準(zhun)確，並且在(zai)檢(jian)測罕見(jian)突變和單(dan)核苷(gan)酸(suan)多態性(xing) (SNP) 等應(ying)用中(zhong)較(jiao)有(you)用(yong)。

當(dang)您考慮(lv)您的(de)應(ying)用時(shi)，決定是選擇終(zhong)點(dian)（定性/半定量）PCR 還是定量（qPCR 或(huo) dPCR）方法(fa)相對簡(jian)單，但(dan) qPCR 和 dPCR 之(zhi)間(jian)的(de)選(xuan)擇可能更加(jia)微(wei)妙。qPCR 具有(you)高(gao)通量(liang)、經濟(ji)高(gao)效且對許多(duo)應(ying)用足(zu)夠靈(ling)敏，但(dan)如(ru)果具(ju)有(you)低(di)檢測限的(de)絕(jue)對量化(hua)至(zhi)關(guan)重要(yao)，則 dPCR 可(ke)能是更好(hao)的(de)選(xuan)擇。

2.溫(wen)度(du)控(kong)制的(de)重要(yao)性(xing)

熱循環儀(yi)準(zhun)確有效地(di)調節和控(kong)制樣品(pin)溫(wen)度(du)的(de)能力(li)是擴(kuo)增(zeng)反應(ying)成功(gong)的(de)關(guan)鍵，應(ying)該成為選(xuan)擇任何 PCR 系統(tong)的(de)重點(dian)。不(bu)同的(de)系(xi)統(tong)可(ke)能在(zai)升溫(wen)速(su)率(lv)、溫(wen)度(du)均勻(yun)性和準(zhun)確性(xing)以(yi)及(ji)跨(kua)熱塊(kuai)實現溫(wen)度(du)梯度(du)以幫(bang)助(zhu) PCR 方法(fa)優(you)化(hua)的(de)能力(li)方面(mian)提(ti)供不同的(de)能力(li)。

升溫(wen)速(su)率(lv)是指熱循環步(bu)驟(zhou)之(zhi)間(jian)溫(wen)度(du)變化(hua)的(de)速(su)度(du)，在儀(yi)器(qi)規格中(zhong)通(tong)常表(biao)示為每(mei)秒(miao)攝氏度(du) (°C/sec)。制造(zao)商(shang)可(ke)能會(hui)提(ti)供有關(guan)最大斜(xie)率(lv)和平(ping)均斜(xie)率(lv)的(de)信(xin)息，並區分(fen)儀(yi)器(qi)的(de)上(shang)升斜(xie)率(lv)（加(jia)熱）和下降斜(xie)率(lv)（冷(leng)卻(que)）。

壹般(ban)來說，更高(gao)的(de)斜(xie)坡率(lv)對應(ying)於(yu)更快(kuai)的(de)運(yun)行(xing)時(shi)間(jian)，但(dan)購(gou)買(mai)者應(ying)註意(yi)不要(yao)只關(guan)註MAX斜(xie)坡率(lv)而不(bu)檢查(zha)與儀(yi)器(qi)速度(du)相關(guan)的(de)其他指標(biao)。儀(yi)器(qi)可能只會在(zai)短時(shi)間(jian)內達(da)到(dao)其較(jiao)高(gao)升溫(wen)速(su)率(lv)，而平(ping)均升溫(wen)速(su)率(lv)將更好(hao)地(di)反映溫(wen)度(du)變化(hua)的(de)速(su)度(du)。雖然(ran)升溫(wen)速(su)率(lv)規格可能給(gei)出(chu)某(mou)些(xie)儀(yi)器(qi)可以(yi)運(yun)行(xing)多(duo)快(kuai)的(de)壹般(ban)概(gai)念(nian)，但(dan)在(zai)可能的(de)情(qing)況下，尋找儀(yi)器(qi)上(shang)展(zhan)示的(de)實際運行(xing)時(shi)間(jian)的(de)數據(ju)，以(yi)真實地了解高(gao)升溫(wen)速(su)率(lv)如(ru)何轉(zhuan)化(hua)為快(kuai)速(su)分析。朗基T30 PCR儀(yi)的(de)升溫(wen)速(su)度(du)甚(shen)至(zhi)可以(yi)達(da)到(dao)7.5℃/sec。

溫(wen)度(du)的(de)準(zhun)確(que)性(xing)和均(jun)勻(yun)性也是成功(gong)反應(ying)的(de)關(guan)鍵，雖(sui)然(ran)所有(you)熱循環儀(yi)的(de)設計都是為了產生 PCR 所(suo)需的(de)溫(wen)度(du)，但(dan)某(mou)些(xie)功(gong)能可(ke)以(yi)提(ti)供更高(gao)的(de)置(zhi)信(xin)度(du)，這對於(yu)樣品(pin)可(ke)能有(you)限且結(jie)果可靠(kao)的(de)應(ying)用至(zhi)關(guan)重要(yao)。當(dang)使用(yong)PCR儀(yi)器(qi)進行(xing)高(gao)分辨率(lv)熔解 (HRM) 分析等敏感技(ji)術(shu)時(shi)，精確(que)的(de)溫(wen)度(du)控(kong)制也至(zhi)關(guan)重要(yao)。

加(jia)熱的(de)蓋(gai)子可(ke)以(yi)確保整(zheng)個(ge) PCR 管更好(hao)的(de)溫(wen)度(du)均勻(yun)性，因(yin)為沒(mei)有加(jia)熱的(de)蓋(gai)子，樣品(pin)會(hui)蒸(zheng)發並凝結(jie)到(dao)溫(wen)度(du)較(jiao)低(di)的(de)管(guan)頂(ding)部(bu)。熱塊(kuai)設計也會影響溫(wen)度(du)控(kong)制；鋁(lv)塊(kuai)導(dao)電(dian)性低(di)，這意(yi)味(wei)著它們將比更導(dao)電(dian)的(de)塊(kuai)更慢(man)地(di)實現溫(wen)度(du)均勻(yun)性並且具(ju)有(you)更低(di)的(de)升溫(wen)速(su)率(lv)。鍍銀(yin)和鍍(du)金(jin)的(de)模(mo)塊(kuai)雖然(ran)昂(ang)貴(gui)，但(dan)可(ke)以更快(kuai)地(di)進行(xing)熱傳遞，從而確(que)保整(zheng)個(ge)塊(kuai)的(de)溫(wen)度(du)分布(bu)均(jun)勻(yun)。

不同的(de) DNA 目(mu)標(biao)可(ke)能需(xu)要(yao)不(bu)同的(de)溫(wen)度(du)才能獲(huo)得(de)較(jiao)好(hao)的(de)擴(kuo)增(zeng)結(jie)果；例如(ru)，富含(han) GC 的(de)序(xu)列(lie)需要(yao)更高(gao)的(de)溫(wen)度(du)才能變(bian)性(xing)。理(li)想的(de)退(tui)火(huo)溫(wen)度(du)也受到(dao)壹系列(lie)因素(su)的(de)影(ying)響——而該步(bu)驟(zhou)的(de)溫(wen)度(du)通常(chang)是根據(ju)引(yin)物的(de)解鏈溫(wen)度(du)、引物(wu)對之(zhi)間(jian)解鏈溫(wen)度(du)的(de)差(cha)異(yi)以及(ji)試(shi)劑(ji)濃度(du)、pH 和鹽(yan)濃度(du)的(de)影(ying)響來選(xuan)擇的(de)。使優(you)化(hua)反應(ying)溫(wen)度(du)條(tiao)件(jian)成(cheng)為壹項(xiang)復(fu)雜(za)的(de)任(ren)務(wu)。

具(ju)有(you)溫(wen)度(du)梯度(du)能力(li)的(de) PCR 儀(yi)器(qi)旨在(zai)通(tong)過允(yun)許在單(dan)次運行(xing)中(zhong)測試(shi)多(duo)個(ge)退火(huo)溫(wen)度(du)來幫(bang)助(zhu)優(you)化(hua) PCR 方法(fa)。根據(ju)您(nin)計劃(hua)使用(yong) PCR 儀(yi)器(qi)分析(xi)的(de)樣品(pin)類(lei)型和多(duo)樣性(xing)，帶(dai)梯度(du)功能的(de)PCR儀(yi)器(qi)雖然(ran)價(jia)格稍高(gao)於(yu)普通(tong)PCR儀(yi)，但(dan)對工(gong)作效(xiao)率(lv)提(ti)升不少(shao)。比如(ru)：朗基系列(lie)的(de) A600系(xi)列(lie)。

3.加(jia)熱模(mo)塊(kuai)

如(ru)前(qian)所(suo)述，與 PCR 儀(yi)器(qi)壹起使用(yong)的(de)加(jia)熱塊(kuai)可以(yi)在(zai)溫(wen)度(du)控(kong)制方面(mian)產生差(cha)異(yi)，但(dan)加(jia)熱塊(kuai)的(de)設計——以(yi)及(ji)儀(yi)器(qi)適應(ying)不同加(jia)熱塊(kuai)的(de)設計——也會影響通量、耗(hao)材成(cheng)本和靈(ling)活性(xing)。典(dian)型(xing)的(de)塊(kuai)將采(cai)用(yong) 96 孔(kong)或(huo) 384 孔(kong)格(ge)式(shi)，但(dan)也可提(ti)供其他格式(shi)，如(ru) 48 孔(kong)和 1536 孔(kong)。孔(kong)數越(yue)高(gao)，反應(ying)體積(ji)越(yue)小，吞(tun)吐量越(yue)高(gao)，最初(chu)成(cheng)本更高(gao)，但(dan)由(you)於(yu)每(mei)個(ge)孔(kong)使用(yong)的(de)試(shi)劑(ji)量(liang)較(jiao)少(shao)，最終(zhong)會降低每(mei)次反應(ying)的(de)價(jia)格(ge)。選(xuan)擇時(shi)需要(yao)考慮(lv)您要(yao)處(chu)理(li)的(de)樣品(pin)數量(liang)以(yi)及(ji)您(nin)使用(yong)儀(yi)器(qi)的(de)頻(pin)率(lv)。

壹些(xie)PCR儀(yi)器(qi)帶(dai)有(you)固定模(mo)塊(kuai)，而其他儀(yi)器(qi)允(yun)許使用(yong)可(ke)互(hu)換塊(kuai)，從而(er)提(ti)供較(jiao)大的(de)靈(ling)活(huo)性(xing)，可(ke)以在 96 孔(kong)和 384 孔(kong)格(ge)式(shi)之(zhi)間(jian)或(huo)在(zai)不(bu)同應(ying)用的(de)不(bu)同塊(kuai)材料(liao)之(zhi)間(jian)切(qie)換。壹些(xie)熱循環儀(yi)還在(zai)同壹臺儀(yi)器(qi)中(zhong)容納多(duo)個(ge)模(mo)塊(kuai)，使不(bu)同的(de)協(xie)議(yi)能夠(gou)同時(shi)在不(bu)同的(de)樣本集(ji)上(shang)運(yun)行(xing)。比如(ru)：朗基的(de)Q2000B熒(ying)光定量PCR儀(yi)同時(shi)用擁(yong)有(you)4通(tong)道檢(jian)測，適用(yong)低位的(de)PCR管(guan)、8聯(lian)排(pai)管(guan)或(huo)96孔(kong)板(ban)。

由(you)於(yu)此(ci)組(zu)件(jian)在(zai)溫(wen)度(du)控(kong)制、樣品(pin)處(chu)理和通(tong)量方面(mian)的(de)關(guan)鍵作用(yong)，因(yin)此在(zai)選擇熱循環儀(yi)時(shi)應(ying)仔細考慮(lv)熱塊(kuai)選項(xiang)。對於(yu)樣品(pin)量(liang)較(jiao)少(shao)的(de)實驗室(shi)，或(huo)者(zhe)那些(xie)通(tong)常只進行(xing)少(shao)量(liang)檢(jian)測的(de)實驗室(shi)，具有(you)標(biao)準(zhun) 96 孔(kong)的(de)低(di)成(cheng)本固定塊(kuai)儀(yi)器(qi)可能就(jiu)足(zu)夠(gou)了。然(ran)而(er)，模(mo)塊(kuai)化、靈(ling)活(huo)的(de)儀(yi)器(qi)可能有(you)利於(yu)具(ju)有(you)更多(duo)協(xie)議、不(bu)同樣本量和更多(duo)用(yong)戶依(yi)賴同壹儀(yi)器(qi)進行(xing)自(zi)己的(de)分(fen)析(xi)的(de)實驗室(shi)，以及(ji)可(ke)能希(xi)望(wang)在(zai)未(wei)來擴(kuo)大其通(tong)量能力(li)的(de)實驗室(shi)。

蘇州(zhou)阿爾(er)法(fa)生物(wu)14年專(zhuan)註生物實驗室(shi)儀(yi)器(qi)設備供(gong)應(ying)和實驗試(shi)劑(ji)、實驗室(shi)耗(hao)材供(gong)應(ying)的(de)服務(wu)商(shang)，提(ti)供的(de)PCR儀(yi)器(qi)、熒光定量PCR儀(yi)、梯度(du)PCR儀(yi)、高(gao)通量(liang)PCR儀(yi)等用於(yu)分(fen)子生(sheng)物(wu)學(xue)研究、生命科(ke)學(xue)等領(ling)域(yu)