應用(yong)差(cha)速(su)離心(xin)法分離外(wai)泌(mi)體的原理

外(wai)泌(mi)體是(shi)壹種(zhong)小(xiao)的 (40-100 nm) 細胞外(wai)膜囊(nang)泡(pao)，目(mu)前進(jin)行外(wai)泌(mi)體分離的(de)普(pu)遍(bian)方(fang)法是(shi)差(cha)速(su)離心(xin)法。

     應用(yong)差(cha)速(su)離心(xin)法和粒(li)徑分(fen)析等(deng)是(shi)細胞外(wai)囊(nang)泡(pao) (EV) 研(yan)究的(de)重(zhong)要步驟(zhou)。已(yi)知(zhi)細胞會(hui)分泌(mi)許多膜囊(nang)泡(pao)，這些囊(nang)泡(pao)的(de)大(da)小(xiao)、分子(zi)含量及其(qi)形成機制(zhi)各(ge)不相同(tong) 具(ju)體取決(jue)於(yu)細胞的類型(xing) 和當前狀(zhuang)態。通(tong)常可(ke)以辨(bian)別(bie)出三(san)個主要的 EV 群(qun)體：雕(diao)亡(wang)小(xiao)體、脫(tuo)落的(de)囊(nang)泡(pao)和外(wai)泌(mi)體  . 雕(diao)亡(wang)小(xiao)體是(shi)已(yi)知(zhi)較(jiao)大(da)的囊(nang)泡(pao)，直徑為(wei) 800-5000 nm，由雕(diao)亡(wang)後細胞的細胞質和質膜成分(fen)組成。脫落(luo)的(de)囊(nang)泡(pao)和外(wai)泌(mi)體由非雕(diao)亡(wang)細胞釋放(fang)。脫落的(de)囊(nang)泡(pao)，也稱(cheng)為(wei)“胞(bao)外(wai)體(ti)"或(huo)有(you)時(shi)稱(cheng)為(wei)“微(wei)泡(pao)"，是(shi)由質膜起泡(pao)產(chan)生的(de)，壹般的(de)粒(li)徑(jing)尺寸範圍(wei)為(wei) (50– 1000 nm)。

   外(wai)泌(mi)體是(shi)內(nei)吞起源(yuan)的小(xiao) (40–100 nm) 囊(nang)泡(pao)群(qun)。外(wai)泌(mi)體和脫(tuo)落的(de)囊(nang)泡(pao)都(dou)含有(you)特定(ding)的蛋(dan)白(bai)質組、RNA 和, dsDNA 等(deng)。不同(tong)的(de)細胞外(wai)環(huan)境富(fu)含不同(tong)類型(xing)的細胞外(wai)囊(nang)泡(pao)。即使(shi)由相同(tong)的(de)細胞類型(xing)形成，不同(tong)類別(bie)的囊(nang)泡(pao)也具(ju)有(you)不同(tong)的(de)核酸特征(zheng)  。

差(cha)速(su)離心(xin)法的原理

離心(xin)管(guan)內(nei)粒(li)子的速(su)度(du)，由三種(zhong)力(li)（離心(xin)力(li)、阿基米德浮(fu)力(li)和斯(si)托(tuo)克(ke)斯粘(zhan)性阻力(li)）的(de)平衡決(jue)定(ding)，如(ru)：

其中(zhong)geff為(wei)離心(xin)力(li)（加速度(du)），R為(wei)旋(xuan)轉(zhuan)半(ban)徑(jing)，即粒(li)子(zi)距旋(xuan)轉(zhuan)軸(zhou)的(de)距離，ω為(wei)旋(xuan)轉(zhuan)角(jiao)頻(pin)率(lv)，d為(wei)粒(li)子(zi)直徑，ρ為(wei)質量(liang)粒(li)子(zi)的密(mi)度(du)和 ρ solv和 η 分(fen)別是(shi)介質的(de)密(mi)度(du)和粘(zhan)度(du)。

    在固(gu)定(ding)的離心(xin)條(tiao)件(jian)（轉(zhuan)速(su)和介質成(cheng)分(fen)）下(xia)，粒子速度(du)由粒子(zi)的形態和密(mi)度(du)決(jue)定(ding)。密(mi)度(du)高(gao)於(yu)介質密(mi)度(du)的(de)粒(li)子(zi)沿(yan)離心(xin)力(li)“向(xiang)下(xia)"運(yun)動，而(er)比介質輕的(de)粒(li)子沿(yan)與(yu)離心(xin)力(li)相反的(de)方(fang)向“上浮(fu)"。對(dui)於(yu)相似(si)的密(mi)度(du)，較(jiao)大(da)的粒子遷(qian)移(yi)得更(geng)快。因(yin)此，在生物(wu)學(xue)中(zhong)，離心(xin)主(zhu)要用(yong)於(yu)按大小(xiao)（差(cha)速(su)和速(su)率區(qu)帶離心(xin)）或(huo)按(an)密(mi)度(du)（等(deng)密(mi)度(du)離心(xin)）分(fen)離不同(tong)的(de)物(wu)體(ti)。在這項研(yan)究中(zhong)，我(wo)們專(zhuan)註於(yu)使用(yong)差(cha)速(su)離心(xin)按(an)大小(xiao)進(jin)行顆粒(li)分級。

       與(yu)等密(mi)度(du)和梯(ti)度(du)離心(xin)相反，差(cha)速(su)離心(xin)從離心(xin)管(guan)內(nei)顆(ke)粒的均(jun)勻(yun)初(chu)始(shi)分(fen)布開始(shi)。在開始(shi)壹輪離心(xin)過(guo)程中(zhong)，位於(yu)管(guan)底(di)部附近(jin)的壹部分目(mu)標(biao)小(xiao)顆粒(li)不可(ke)避免(mian)地(di)與(yu)較(jiao)大(da)顆粒共同(tong)沈澱(dian)。這種(zhong)共(gong)沈澱(dian)導(dao)致(zhi)較(jiao)小(xiao)顆粒(li)的產(chan)量降(jiang)低。然而，選擇大(da)顆(ke)粒(li)，起初(chu)位於(yu)管(guan)半(ban)月(yue)板(ban)附近(jin)，在開始(shi)壹輪離心(xin)過(guo)程中(zhong)可(ke)能沒(mei)有(you)足夠(gou)的(de)時(shi)間(jian)到達(da)管(guan)底(di)，從而汙(wu)染最(zui)後壹個離心(xin)步(bu)驟(zhou)產(chan)生的(de)小(xiao)顆粒(li)顆粒(li)。

       顯然，交(jiao)叉汙染的程(cheng)度(du)取(qu)決(jue)於(yu)不同(tong)粒(li)子群(qun)的相對沈降(jiang)速度(du)和離心(xin)條(tiao)件(jian)。在被分(fen)離的(de)粒(li)子的(de)沈降(jiang)速度(du)之間(jian)存在顯著(zhe)（數量級）差(cha)異(yi)的(de)情況下(xia)，可(ke)以有(you)效地(di)優化差(cha)速(su)離心(xin)協(xie)議以獲(huo)得目(mu)標(biao)粒(li)子(zi)群(qun)的(de)高(gao)產(chan)量(liang)和足夠(gou)純(chun)度(du)。此(ci)外(wai)，當不同(tong)顆(ke)粒部分之間(jian)的沈降(jiang)速率僅存在微小(xiao)差(cha)異(yi)時(shi)，優化過(guo)程不太(tai)成(cheng)功。在這些情況下(xia)，取決(jue)於(yu)離心(xin)條(tiao)件(jian)。

       任(ren)何外(wai)泌(mi)體分離方(fang)案旨(zhi)在獲(huo)得產(chan)量(liang)合理且不受細胞碎片(pian)、細胞器(qi)和雕(diao)亡(wang)小(xiao)體汙(wu)染的(de)外(wai)泌(mi)體群體，理想情況下(xia)，不含其他(ta)類型(xing)的細胞外(wai)囊(nang)泡(pao)、蛋(dan)白(bai)質及其(qi)聚集(ji)體(ti)。由於大(da)小(xiao)差(cha)異(yi)很大，將(jiang)外(wai)泌(mi)體與(yu)細胞、細胞碎片(pian)和大(da)囊(nang)泡(pao)分(fen)離相對容(rong)易。巨(ju)大的(de)挑戰(zhan)是(shi)從小(xiao)的脫(tuo)落囊(nang)泡(pao)中(zhong)純(chun)化(hua)外(wai)泌(mi)體，因為(wei)它(ta)們(men)的大(da)小(xiao)非常(chang)相似(si)。通(tong)過(guo)差(cha)速(su)離心(xin)分(fen)離這些細胞外(wai)囊(nang)泡(pao)既困難(nan)又低效(xiao)。所以需(xu)要根據轉(zhuan)子(zi)的(de)特性(xing)和要分離的(de)顆(ke)粒的(de)特性(xing)，來(lai)對離心(xin)參(can)數應進(jin)行調整。因(yin)為(wei)離心(xin)速(su)度(du)與(yu)粒子(zi)的(de)旋(xuan)轉(zhuan)半(ban)徑(jing)成(cheng)正比，所以離心(xin)運(yun)動加速。粒(li)子(zi)的徑向(xiang)坐標(biao)隨(sui)時(shi)間(jian)t呈(cheng)指(zhi)數增長。

離心(xin)機(ji)轉(zhuan)子(zi)的(de)選擇(ze)

    使用(yong)差(cha)速(su)離心(xin)法分離外(wai)泌(mi)體主要需(xu)要註意(yi)的(de)是(shi)轉(zhuan)子(zi)的(de)選擇(ze)。“擺(bai)動桶"(SW) 轉(zhuan)子(zi)和“定(ding)角(jiao)"(FA) 轉(zhuan)子(zi)， 這些轉(zhuan)子(zi)的(de)幾(ji)何形狀根本(ben)不同(tong)，因(yin)此沈降(jiang)特性(xing)也不同(tong)。這些轉(zhuan)子(zi)之間(jian)的主(zhu)要區別(bie)在於： FA 轉(zhuan)子(zi)，與(yu)旋轉(zhuan)半(ban)徑(jing)相比，沈積顆粒的較(jiao)大(da)路(lu)徑長(chang)度(du)通(tong)常較(jiao)小(xiao)，允(yun)許近似(si)恒定(ding)遷移(yi)率並簡化描(miao)述(shu)。然而，第二個區別(bie)是(shi)圓(yuan)形 FA 管(guan)的(de)水(shui)平橫(heng)截面(mian)是(shi)橢(tuo)圓形的，不同(tong)粒(li)子的(de)路(lu)徑長(chang)度(du)根據軌(gui)跡(ji)與(yu)橢圓(yuan)長(chang)軸(zhou)的(de)距(ju)離而(er)不同(tong)。由於較(jiao)短(duan)的路(lu)徑長(chang)度(du)，外(wai)圍(wei)顆(ke)粒(li)可(ke)能沈降(jiang)得更(geng)快，需(xu)要根據不同(tong)的(de)實(shi)驗(yan)需(xu)要進(jin)行選擇(ze)。

蘇(su)州(zhou)阿爾(er)法生物(wu)提供(gong)的超速離心(xin)機(ji)、低速(su)離心(xin)機(ji)、落地(di)式(shi)離心(xin)機(ji)、臺(tai)式(shi)離心(xin)機(ji)、納米(mi)粒(li)徑(jing)分(fen)析儀(yi)廣(guang)泛(fan)應用(yong)於(yu)差(cha)速(su)離心(xin)法分離外(wai)泌(mi)體及外(wai)泌(mi)體形態、電(dian)位(wei)、粒(li)徑(jing)分(fen)析等實(shi)驗(yan)。