外(wai)泌(mi)體的結(jie)構功(gong)能(neng)和(he)外泌(mi)體分(fen)離(li)方法(fa)

 外泌(mi)體通常被(bei)認(ren)為是細胞間(jian)信號分(fen)子，包含(han)許多蛋(dan)白質、核酸(suan)、細胞因(yin)子、轉(zhuan)錄(lu)因(yin)子和(he)其他細胞來源的顆粒(li)。外泌(mi)體不(bu)僅(jin)可以(yi)向局(ju)部環境傳(chuan)遞(di)信(xin)息(xi)，還(hai)可以(yi)向距(ju)離(li)很遠(yuan)的細(xi)胞和組織(zhi)傳(chuan)遞(di)信(xin)息(xi)。這(zhe)可(ke)能(neng)作(zuo)為壹(yi)般(ban)信號(hao)和通信通路，但也可(ke)能(neng)參(can)與致癌(ai)基因(yin)擴散(san)和惡(e)性腫(zhong)瘤進壹(yi)步(bu)惡(e)化(hua)。迄(qi)今為止，已證(zheng)實外(wai)泌(mi)體存(cun)在(zai)於(yu)體液(ye)中，例如羊水、血清(qing)、母(mu)乳(ru)、附(fu)睪(gao)液(ye)、唾液(ye)、尿液、腹(fu)水和胸(xiong)腔積(ji)液(ye)、支氣管(guan)肺泡(pao)灌洗液(ye)、滑(hua)液和(he)體外細胞培(pei)養上(shang)清(qing)液(ye)中(zhong) 。細胞排出的外(wai)泌(mi)體也(ye)可作(zuo)為去除(chu)不(bu)必(bi)要(yao)的蛋(dan)白質和核(he)酸(suan)的壹(yi)種(zhong)方式(shi)，例如(ru)，在細胞成(cheng)熟（網織(zhi)紅(hong)細(xi)胞）或排泄(xie)系統(tong)（腎的內(nei)臟(zang)和小(xiao)管(guan) ）期間(jian)的外(wai)泌(mi)體。

     為了(le)正(zheng)確(que)使(shi)用(yong)外(wai)泌(mi)體作(zuo)為 DDS，我(wo)們必(bi)須(xu)考慮(lv)外泌(mi)體的成(cheng)分(fen)和它(ta)們(men)的形(xing)成(cheng)途(tu)徑。然後，還(hai)應描(miao)述(shu)外(wai)泌(mi)體親(qin)和力和(he)細胞攝取的特(te)征(zheng)。外泌(mi)體載體表現出不(bu)同的目(mu)的和(he)功(gong)能(neng)，這(zhe)要(yao)歸功(gong)於(yu)外泌(mi)體作(zuo)為基本的轉(zhuan)運體本身(shen)就(jiu)具有(you)出色(se)的特(te)性(xing)。這可(ke)以(yi)用(yong)於(yu)細胞靶向，也可(ke)以(yi)作(zuo)為藥(yao)物的額(e)外(wai)增(zeng)強。迄(qi)今為止，ExoCarta 在(zai)外泌(mi)體中(zhong)發現了(le)大(da)約(yue) 10,000 種(zhong)蛋白質、3500 種(zhong) mRNA 和超過 1100 種(zhong)不(bu)同的脂(zhi)質(zhi)。 對於(yu)系統(tong)審查(zha)，出現了(le)許(xu)多很(hen)棒的數(shu)據(ju)庫，例(li)如Vesiclepedia和 ExoCarta，其中描(miao)述(shu)了(le)外(wai)泌(mi)體分(fen)離(li)程序和來(lai)源以(yi)及(ji)已識(shi)別的載體.
     外(wai)泌(mi)體蛋(dan)白質特征(zheng)是:膜(mo)結(jie)合(he)四(si)跨(kua)膜(mo)蛋(dan)白（CD9、CD63、 CD81 和 CD82），以(yi)及(ji)常規(gui)用(yong)於(yu)分(fen)離(li)的 EpCAM 和(he) Rab5 。其(qi)他蛋(dan)白質是受體（CD46 和 CD55）、熱(re)休克蛋白（HSP ；Hsc70、Hsp70 和 Hsp90）、參與外(wai)泌(mi)體形(xing)成(cheng)的蛋(dan)白質（ Alix、TSG101）和負(fu)責融合(he)和轉(zhuan)運的膜(mo)蛋(dan)白（GTP 酶、膜(mo)聯(lian)蛋(dan)白和 flotillin；ATP7A、ATP7B、MRP2  、SLC1A4 、SLC16A1 和 CLIC1)等(deng)。使(shi)用(yong) ELISA法(fa)檢測(ce)這些標(biao)記(ji)蛋(dan)白可以(yi)用(yong)於(yu)確認(ren)外(wai)泌(mi)體的存(cun)在(zai)。
     也有(you)相(xiang)關(guan)研究稱(cheng)外泌(mi)體含(han)有(you)其(qi)他顆粒(li)，如膽(dan)固(gu)醇(chun)（B 淋巴(ba)細胞來源）、鞘脂、磷(lin)酸(suan)甘油酯(zhi)和(he)神經酰(xian)胺(an)等。外泌(mi)體還(hai)運輸(shu)形(xing)態發生(sheng)素（Hedgehog、 Wingless 和(he) Wingless-like），參(can)與黑(hei)腹(fu)果(guo)蠅(ying)所(suo)描(miao)述(shu)的組(zu)織(zhi)模(mo)式發(fa)育。
         核(he)酸(suan)是在外泌(mi)體中(zhong)發現的另(ling)壹(yi)組(zu)主(zhu)要(yao)顆粒(li)，即(ji) DNA 和 RNA，它們(men)可(ke)以(yi)在細(xi)胞中發揮功(gong)能(neng)作(zuo)用(yong)。在(zai)源自小(xiao)鼠和(he)人類肥(fei)大(da)細胞的外(wai)泌(mi)體中(zhong)發現了(le)約(yue) 1300 種(zhong) mRNA、121 種(zhong) miRNA 和 >100 種(zhong)小 RNA，但(dan)未檢測(ce)到(dao) DNA 和(he) rRNA 。 在外泌(mi)體中(zhong)發現的其(qi)他(ta) miRNA 是 lin-4 和 let-7 ，以(yi)及(ji)母(mu)乳(ru)中(zhong)的 miR-181a 和(he) miR-155。

壹(yi)些外(wai)泌(mi)體 miRNA 可(ke)用(yong)作(zuo)診斷(duan)中(zhong)的生(sheng)物標(biao)誌物(wu)（ 表 2）。

小(xiao)鼠外(wai)泌(mi)體對(dui)人類細(xi)胞的刺(ci)激(ji)可以(yi)導致人類細(xi)胞中小鼠蛋(dan)白質的合(he)成(cheng)。此(ci)外(wai)，外(wai)泌(mi)體和(he)受體細(xi)胞的 mRNA 譜不(bu)同，表明 mRNA 被主(zhu)動分(fen)選為 MVB。
外泌(mi)體的分(fen)離(li)方法(fa)
目(mu)前(qian)，有(you)許(xu)多可(ke)用(yong)的外(wai)泌(mi)體分(fen)離(li)方法(fa)（ 表 1）。比較傳(chuan)統(tong)的外(wai)泌(mi)體分(fen)離(li)方法(fa)是超速(su)離(li)心，許(xu)多人將(jiang)其視(shi)為金標(biao)準(zhun)。其他(ta)技術主(zhu)要(yao)基於(yu)大小(xiao)排阻或抗體介導的標(biao)記(ji)外(wai)泌(mi)體分(fen)離(li)。每種(zhong)分(fen)離(li)方法(fa)在(zai)純(chun)度、數(shu)量(liang)、效率(lv)和通量(liang)方(fang)面(mian)都不(bu)同。超速(su)離(li)心法(fa)分(fen)離(li)法 的缺(que)點是外泌(mi)體結(jie)構容(rong)易發生(sheng)改變(bian)，造成(cheng)外泌(mi)體的結(jie)構不(bu)壹(yi)致性(xing)甚(shen)至(zhi)會(hui)導致外(wai)泌(mi)體受(shou)損。
表 1. 外泌(mi)體分(fen)離(li)方法(fa)。

1.超速(su)離(li)心法(fa)：
   超速(su)離(li)心基於(yu)顆粒(li)的大(da)小(xiao)（重(zhong)量(liang)）及(ji)其(qi)在離(li)心力(li)（100,000–110,000× g）下(xia)的離(li)心沈(chen)降。至於(yu)去除(chu)的細(xi)胞碎(sui)片(pian)和不(bu)需要(yao)的顆粒(li)可以(yi)通過稱(cheng)為差(cha)速(su)離(li)心的幾步慢(man)速(su)離(li)心來(lai)獲(huo)得(de)。外泌(mi)體的純(chun)化(hua)可(ke)以(yi)采用(yong)蔗(zhe)糖(tang)梯(ti)度密(mi)度離(li)心純(chun)化(hua)法(fa)：即(ji)：在蔗(zhe)糖(tang)梯(ti)度 (1.13–1.19 g/mL) 或(huo)緩沖液中(zhong)進行，以(yi)實現更高的富集(ji)、產量(liang)和(he)純(chun)度增(zeng)加。 
2.超濾(lv)法：
   超濾(lv)法使(shi)用(yong)的是微孔(kong)過濾器(qi)；因(yin)此(ci)，較(jiao)大(da)的顆粒(li)將(jiang)從(cong)濾(lv)液(ye)中(zhong)排除(chu)。它(ta)可以(yi)與離(li)心結(jie)合(he)使(shi)用(yong)，通過初(chu)步去(qu)除(chu)細(xi)胞碎(sui)片(pian)等大顆粒(li)來加速(su)外(wai)泌(mi)體的純(chun)化(hua)。不(bu)過使(shi)用(yong)此(ci)方(fang)法(fa)需(xu)要(yao)防止(zhi)孔(kong)隙堵(du)，不(bu)適(shi)合(he)大規(gui)模的樣本處理。
3.尺(chi)寸(cun)排阻層析法
    尺(chi)寸(cun)排阻層析法也(ye)被(bei)稱(cheng)為凝膠過濾層(ceng)析法，這(zhe)種(zhong)方法(fa)是基於(yu)凝膠孔(kong)的大(da)小(xiao)和外(wai)泌(mi)體的大(da)小(xiao)，大於(yu)凝膠孔(kong)徑的顆粒(li)被洗脫；反(fan)之(zhi)，小於(yu)凝膠孔(kong)徑的顆粒(li)將(jiang)被抑(yi)制(zhi)。凝膠過濾層(ceng)析 分(fen)離(li)法總(zong)體(ti)上(shang)能(neng)獲(huo)得(de)較高的純(chun)度和(he)產量(liang)。建議與超濾(lv)相結(jie)合(he)，這種(zhong)方法(fa)可提(ti)供(gong)更(geng)少的蛋(dan)白質汙染(ran)和更高的外(wai)泌(mi)體回(hui)收(shou)率(lv)。 凝膠過濾層(ceng)析分(fen)離(li)法的缺(que)點是凝膠的成(cheng)本過高。
4.沈(chen)澱分(fen)離(li)方法(fa)：
   基於(yu)聚合(he)物的沈(chen)澱(dian)分(fen)離(li)方法(fa)是利(li)用(yong)超親(qin)水聚合(he)物來(lai)增(zeng)強小(xiao)尺(chi)寸(cun)顆粒(li)（如外(wai)泌(mi)體）的沈(chen)澱(dian)。聚乙(yi)二(er)醇(chun)的常用(yong)濃度在(zai) 8% 到(dao) 15% 之(zhi)間(jian)變化(hua)。使(shi)用(yong)這(zhe)種(zhong)方法(fa)，將(jiang)含(han)有(you)外(wai)泌(mi)體的溶液與聚(ju)合(he)物壹(yi)起(qi)孵育過夜，並(bing)在約 10,000× g下進壹(yi)步(bu)離(li)心。
5.免疫學分(fen)離(li)方法(fa)
   免疫學分(fen)離(li)法是利(li)用(yong)受(shou)位(wei)於(yu)外泌(mi)體膜(mo)中(zhong)的選(xuan)定(ding)蛋白質標記(ji)物(wu)影響的抗(kang)體(ti)對外(wai)泌(mi)體進行標記(ji)。這(zhe)些標(biao)記(ji)的外(wai)泌(mi)體可(ke)以(yi)進壹(yi)步(bu)輕松處理和(he)純(chun)化(hua)，例(li)如，使(shi)用(yong)微(wei)芯片(pian)或磁珠(zhu)。磁分(fen)離(li)後，外(wai)泌(mi)體被(bei)純化(hua)，磁(ci)珠(zhu)被溶解和(he)去(qu)除。通過這種(zhong)簡單快速的方(fang)法(fa)，就(jiu)可以(yi)獲(huo)得(de)較高純(chun)度提(ti)取物(wu)，但(dan)不(bu)會(hui)分(fen)離(li)出缺乏(fa)磁(ci)性(xing)標(biao)記(ji)抗(kang)體(ti)識別的表面標記(ji)的外(wai)泌(mi)體，這(zhe)可能(neng)導致外(wai)泌(mi)體池(chi)表現效果(guo) 不(bu)佳。這(zhe)種(zhong)方法(fa)雖然既省時又直接(jie)，輸(shu)出純度較(jiao)高，但也(ye)需要(yao)較為昂(ang)貴(gui)的試(shi)劑。
6.親和層析分(fen)離(li)法
在(zai)親(qin)和(he)層(ceng)析分(fen)離(li)法方(fang)面(mian)，主(zhu)要(yao)使(shi)用(yong)凝(ning)集(ji)素和(he)合(he)成(cheng) Vn (venceremin) 肽(tai)。凝(ning)集(ji)素將(jiang)結(jie)合(he)存(cun)在(zai)於(yu)外泌(mi)體表面的糖(tang)基化(hua)蛋(dan)白質，從(cong)而(er)使(shi) 外(wai)泌(mi)體沈(chen)澱。Vn 肽(tai)分(fen)離(li)技術基於(yu)其對(dui)含(han)有(you) HSP 的細(xi)胞外顆粒(li)的高(gao)親(qin)和力(li)。然而，這種(zhong)方法(fa)比較(jiao)容(rong)易使(shi)提(ti)取物(wu)被(bei)膜(mo)表面上(shang)含(han)有(you)上(shang)述(shu)標(biao)記(ji)物(wu)的細(xi)胞和其他顆粒(li)汙染(ran)。
7.微流控(kong)分(fen)離(li)法
  微(wei)流(liu)控(kong)分(fen)離(li)法主(zhu)要(yao)是在微芯片(pian)上(shang)進行的，這(zhe)裏(li)我(wo)們需要(yao)提及(ji)的是，微流控(kong)分(fen)離(li)法法(fa)可(ke)用(yong)於(yu)外泌(mi)體分(fen)離(li)（免疫結(jie)合(he)和磁(ci)結(jie)合(he)、過濾），效率(lv)相對較高（約 90%）。
8.FFF分(fen)離(li)法
  FFF 目(mu)前(qian)是壹(yi)種(zhong)很少使(shi)用(yong)但(dan)前景不(bu)錯(cuo)的壹(yi)種(zhong)外泌(mi)體分(fen)離(li)方法(fa)。分(fen)離(li)由橫流(liu)力驅(qu)動，並(bing)基於(yu)顆粒(li)的分(fen)子量(liang)或(huo)流(liu)體動力學直(zhi)徑。它包括(kuo)高(gao)純度、高(gao)效率(lv)和短時間(jian)處理，但(dan)迄(qi)今為止，FFF 在(zai)外泌(mi)體分(fen)離(li)中的使(shi)用(yong)案(an)例較少 ，還(hai)有(you)待進壹(yi)步(bu)開(kai)發(fa) 。
9.聲學流體(ti)分(fen)離(li)
   聲學(xue)流(liu)體(ti)分(fen)離(li)技術利(li)用(yong)聲(sheng)場根據粒(li)子的大(da)小(xiao)、密度和(he)可壓縮性來分(fen)離(li)粒(li)子。生(sheng)物樣品(pin)在(zai)此(ci)過程中(zhong)不(bu)會(hui)受到(dao)損(sun)壞，並(bing)且分(fen)離(li)的本身(shen)是非接(jie)觸式(shi)、高(gao)效的和(he)無標記(ji)的。
10.納米(mi)粒(li)徑分(fen)析法(fa)
   確(que)定性橫向位(wei)移依賴(lai)於(yu)顆粒(li)流動路徑的變(bian)化(hua)，而(er)顆粒(li)流動路徑取決(jue)於(yu)顆粒(li)尺寸(cun)。這種(zhong)方法(fa)雖然比較簡單，但是需要(yao)使(shi)用(yong)掃(sao)描(miao)電鏡技術、動態光散(san)射(she)技術、納米(mi)粒(li)子跟(gen)蹤分(fen)析技術、單粒(li)子幹涉反(fan)射(she)成(cheng)像傳(chuan)感器（SP-IRIS）技術等。對(dui)於(yu)外泌(mi)體大(da)小、形(xing)態、外泌(mi)體的 濃度、zeta電位(wei)等分(fen)析也(ye)可(ke)以(yi)使(shi)用(yong)Nanocoulter粒(li)度分(fen)析儀。


11.介電泳分(fen)離(li)法：
介電泳分(fen)離(li)法主(zhu)要(yao)利(li)用(yong)不(bu)同大(da)小的粒(li)子在(zai)不(bu)均(jun)勻電場中(zhong)的位(wei)置差(cha)異(yi)。外泌(mi)體被(bei)吸引(yin)到(dao)高(gao)電區域(yu)，而(er)較大的顆粒(li)將(jiang)位(wei)於(yu)低電區域(yu)。該方法(fa)速度快(kuai)，適(shi)合(he)用(yong)於(yu)高通量(liang)篩(shai)選，但(dan)缺點是需要(yao)加熱(re)。
          蘇州阿(e)爾法生(sheng)物實驗(yan)器(qi)材有(you)限(xian)公(gong)司14年(nian)專(zhuan)註於(yu)生(sheng)物實驗(yan)室(shi)儀器(qi) 和(he)生(sheng)物試(shi)劑、實驗(yan)室(shi)耗材的專(zhuan)業供(gong)應(ying)商(shang)。提供(gong)的粒(li)度分(fen)析儀、熒光(guang)顯微(wei)鏡等(deng)廣泛(fan)應(ying)用(yong)於(yu)細胞外泌(mi)體的研究。另外，提(ti)供(gong)的 質(zhi)粒(li)提取試(shi)劑盒(he)、PCR試(shi)劑、壹(yi)抗(kang)、雙抗、二(er)抗、抗(kang)體蛋白、單克隆抗體、基因(yin)組提(ti)取試(shi)劑盒(he)、RNA提取試(shi)劑盒(he)、Qpcr試(shi)劑、培(pei)養基、胎牛(niu)血(xue)清(qing)等(deng)生(sheng)物 試(shi)劑也廣泛(fan)應(ying)用(yong)於(yu)生(sheng)命(ming)科(ke)學實驗(yan)。