細(xi)胞(bao)外(wai)泌(mi)體(ti)來源和外(wai)泌(mi)體(ti)的表征方法(fa)

細胞(bao)外(wai)泌(mi)體(ti)來源及表征(zheng)方法(fa)

細(xi)胞(bao)外(wai)泌(mi)體(ti)是直(zhi)徑為 30-150 nm 的(de)血管(guan)外(wai)囊(nang)泡(pao)亞(ya)群。在過(guo)去的20年裏(li)，科(ke)學(xue)家(jia)已(yi)經(jing)從(cong)包括(kuo)正常細胞(bao)和癌細(xi)胞(bao)在內(nei)的(de)許多(duo)細胞(bao)類(lei)型(xing)中(zhong)分(fen)離(li)出外(wai)泌(mi)體(ti)，並且(qie)研究了(le)它們(men)對(dui)其(qi)他(ta)細(xi)胞(bao)的影響。外(wai)泌(mi)體(ti)是由多種(zhong)大分(fen)子(zi)組(zu)成，例如核(he)酸、蛋白(bai)質和脂(zhi)質。

細(xi)胞(bao)外(wai)泌(mi)體(ti)具有(you)天然(ran)的(de)特定(ding)細胞(bao)靶向(xiang)特性(xing)，通(tong)常(chang)被(bei)設(she)計用於靶向(xiang)大分(fen)子(zi)（DNA 和 RNA）和藥物遞送(song)系(xi)統（多柔比(bi)星(xing)、紫杉醇和紫(zi)杉醇）。目前(qian)常用細胞(bao)外(wai)泌(mi)體(ti)的分(fen)離(li)方法(fa)主(zhu)要(yao)是超速離(li)心法(fa)、密(mi)度(du)梯度離(li)心法(fa)、超(chao)濾(lv)分(fen)離(li)法(fa)、基於聚(ju)合(he)物的沈(chen)澱(dian)法(fa)、親(qin)和沈(chen)澱分(fen)離(li)法(fa)、  免疫磁珠(zhu)法(fa)和色(se)譜法(fa)等(deng)

壹(yi)、外(wai)泌(mi)體(ti)來源及其釋放途(tu)徑
外(wai)泌(mi)體(ti)在人(ren)體的主要(yao)作(zuo)用是充(chong)當(dang)局(ju)部和全(quan)身(shen)信號(hao)和調(tiao)節(jie)系(xi)統。外(wai)泌(mi)體(ti)（直(zhi)徑 30-150 nm）是較(jiao)小的(de)血管(guan)外(wai)囊(nang)泡(pao)亞(ya)群，它的還包括(kuo)微泡（50 nm-1 μ m）和雕(diao)亡小體（ 50 nm-5 μm）。

外(wai)泌(mi)體(ti)的來源是內(nei)體(ti)系(xi)統。由內(nei)膜出芽(ya)形成早期核(he)內(nei)體(ti)，早期內(nei)體(ti)可以與(yu)內(nei)吞小(xiao)泡(pao)融(rong)合(he)，從(cong)而引(yin)導(dao)它(ta)們的貨物進行(xing)回收、降解或分(fen)泌(mi)。當(dang)早期內(nei)體(ti)成熟(shu)為晚(wan)期內(nei)體(ti)時，在(zai)它們(men)成(cheng)熟(shu)為晚(wan)期核(he)內(nei)體(ti)的過(guo)程中(zhong)，囊(nang)泡(pao)膜向(xiang)內(nei)出芽(ya)，導(dao)致多泡體 (MVB) 的(de)產生(sheng)，其中包含(han)許多腔內(nei)囊(nang)泡(pao) (ILV).  在此(ci)階段，MVB 可以與(yu)溶(rong)酶(mei)體(ti)融(rong)合(he)（ILV 繼續降解）或與(yu)質膜融(rong)合(he)，導(dao)致 ILV  釋放到(dao)細胞(bao)外(wai)空(kong)間。這(zhe)些釋放的(de) ILV 稱為(wei)外(wai)泌(mi)體(ti)，包含著(zhe)許多(duo)源自細胞(bao)內(nei)部的(de)蛋白(bai)質、核(he)酸、脂(zhi)質和多(duo)糖(tang) 。 另(ling)壹種(zhong)釋放機(ji)制(zhi)就是由於質膜向(xiang)外(wai)出芽(ya)，從(cong)而導(dao)致形成所(suo)謂(wei)的脫(tuo)落(luo)微泡或(huo)外(wai)泌(mi)體(ti) 。
 
二(er)、 外(wai)泌(mi)體(ti)的表征方法(fa)
根據藥物遞送(song)系(xi)統 (DDS) 表征(zheng)外(wai)泌(mi)體(ti)結構(gou)至關(guan)重要(yao)，因為(wei)它決(jue)定(ding)了(le) DDS 的特性(xing)，例如細(xi)胞(bao)或組(zu)織親(qin)和力(li)、應激反(fan)應、吸收途(tu)徑和藥物釋放。 2014  年(nian)和 2018 年(nian)國際細胞(bao)外(wai)囊(nang)泡(pao)學會 (MISEV2018) 提出了(le)外(wai)泌(mi)體(ti)（包括(kuo)研究和外(wai)泌(mi)體(ti)制備）應滿(man)足的(de)基本(ben)要(yao)求指南(nan)。在(zai)開(kai)發基於外(wai)泌(mi)體(ti)的  DDS 時，必須(xu)考(kao)慮(lv)數(shu)量、大小、形態(tai)、膜組(zu)成(cheng)和蛋白(bai)質（包(bao)括(kuo)受體）等(deng)參數(shu)。這些參數(shu)表征所(suo)用的技(ji)術(shu)主(zhu)要(yao)為光學、非光學和微流體技(ji)術(shu)。

1.光學方法(fa)
目(mu)前(qian)，光學方法(fa)是(shi)外(wai)泌(mi)體(ti)表征的主(zhu)要(yao)方法(fa)，即(ji)動態(tai)光散(san)射 (DLS)、多角(jiao)度光散(san)射 (MALS) 和納米(mi)粒(li)子(zi)跟蹤分(fen)析(xi) (NTA)  。這(zhe)些方法(fa)允許對(dui)尺(chi)寸（DLS 0.5–200 nm；MALS 10 –500 nm；NTA 10–1000 nm ）、尺(chi)寸分(fen)布(bu)和濃(nong)度進行(xing)高分(fen)辨(bian)率(lv)測量(liang)。 DLS 和 MALS 的(de)結合增加(jia)了(le)測量(liang)範圍(wei) (0.5–500 nm)  和精度。光學方法(fa)比(bi)較受歡(huan)迎(ying)的，但(dan)缺(que)點(dian)是(shi)靈敏(min)度(du)低(di)、試劑(ji)消(xiao)耗高以及(ji)需(xu)要(yao)昂(ang)貴(gui)的(de)設(she)備。
在使用 納米(mi)粒(li)子(zi)跟蹤分(fen)析(xi)NTA 方法(fa)過(guo)程中(zhong)，熒光染料的(de)加(jia)入也提高(gao)了(le)分(fen)辨(bian)率(lv)，並(bing)允許通(tong)過(guo)使用熒光標(biao)記(ji)來表征表(biao)面免疫表型(xing)。從(cong)而確(que)定標(biao)記(ji)物存(cun)在。

2.非光學方法(fa)
非光學方法(fa)主(zhu)要(yao)包括(kuo)掃(sao)描(miao)電子(zi)顯(xian)微鏡(jing)（SEM）、透(tou)射電子(zi)顯(xian)微鏡(jing)（TEM）、冷(leng)凍(dong)電子(zi)顯(xian)微鏡(jing)（Cryo-EM  ）、原(yuan)子(zi)力(li)顯微鏡(jing)（AFM）、免疫檢測方法(fa)（ELISA）、傅立(li)葉(ye)變(bian)換紅外(wai)光譜（FTIR  ）、可調(tiao)諧電阻脈沖傳感(gan) (TRPS) 和單(dan)粒(li)子(zi)幹涉(she)反(fan)射成像(xiang)傳感(gan)器(qi) (SP-  IRIS ) 。 SEM、TEM 和 AFM 方法(fa)通(tong)常(chang)用於直(zhi)接(jie)膜結(jie)構(gou)和形態(tai)測定(ding)，而  ELISA 檢測提供各種(zhong)結構(gou)顆(ke)粒(li)（主(zhu)要(yao)是蛋白(bai)質和受體）的(de)檢(jian)測和量(liang)化，例如，用於外(wai)泌(mi)體(ti)形態(tai)的 確認(ren)。
   
FTIR 光譜和衰(shuai)減全(quan)反(fan)射 FTIR (ATR-FTIR) 常用於外(wai)泌(mi)體(ti)質量(liang)量(liang)化(hua)和脂(zhi)質和蛋白(bai)質含(han)量(liang)的(de)總體估(gu)計。使用 TRPS  ，可以同時(shi)測量(liang)大小、濃度和 zeta 電位(wei)。由於掃(sao)描(miao)電子(zi)顯(xian)微鏡(jing)（SEM）、透(tou)射電子(zi)顯(xian)微鏡(jing)的(de)成本(ben)較高，近(jin)些年來(lai)，壹(yi)種(zhong)新型(xing)的(de)納米(mi)粒(li)度(du)分(fen)析(xi)儀(yi)器(qi)在外(wai)泌(mi)體(ti)研究領(ling)域(yu)迅速(su)發展(zhan)，比(bi)如 Nanocoulter粒(li)度(du)分(fen)析(xi)儀(yi)可(ke)以不僅(jin)可(ke)以進(jin)行(xing) 單顆(ke)粒(li)檢(jian)測，顆(ke)粒(li)粒(li)徑檢測還(hai)可以檢(jian)測細(xi)胞(bao)外(wai)泌(mi)體(ti)的濃度、zeta電位(wei)、形態(tai)等(deng)進(jin)行(xing)多維度檢(jian)測。

單(dan)粒(li)子(zi)幹涉(she)反(fan)射成像(xiang)傳感(gan)器(qi) (SP-IRIS) 也用於外(wai)泌(mi)體(ti)定量，但也可用於檢(jian)測特定(ding)標(biao)記(ji)物和確(que)定外(wai)泌(mi)體(ti)亞(ya)群. 

3.微流體分(fen)析(xi)技(ji)術(shu)
微流體技(ji)術(shu)在(zai)外(wai)泌(mi)體(ti)研究方面也起著(zhe)推動(dong)作(zuo)用。微流體技(ji)術(shu)不僅(jin)提供了(le)高質量(liang)、高(gao)特異性(xing)的(de)數(shu)據，並且(qie)試劑(ji)消(xiao)耗量低(di)，通(tong)量(liang)高(gao). 

基於微流體技(ji)術(shu)的(de)研究方法(fa)需(xu)要(yao)結合使用微流控芯片，微流控芯片通(tong)常(chang)由玻璃(li)基和聚(ju)二(er)甲基矽(gui)氧烷 (PDMS) 膜制(zhi)成(cheng)，包(bao)含(han)許多(duo)尺(chi)寸適合(he)所(suo)分(fen)析(xi)樣(yang)品(pin)的微通(tong)道(dao)。主要(yao)區(qu)別在於(yu)芯(xin)片的內(nei)表(biao)面，可(ke)以通(tong)過(guo)多種(zhong)方式對(dui)其(qi)進(jin)行(xing)功(gong)能(neng)化(hua)，例如通(tong)過(guo)塗層、多(duo)層沈積、電沈(chen)積和  蝕(shi)刻. 目前研究中(zhong)針對(dui)不同的(de)微流控表征(zheng)方法(fa)，也制造了(le)不同類(lei)型(xing)的(de)微芯片，包括(kuo)免疫芯片、磁性(xing)芯(xin)片和電化(hua)學(xue)芯片。

外(wai)泌(mi)體(ti)及其蛋白(bai)質也可以通(tong)過(guo)比(bi)色法(fa)（標(biao)記(ji)抗體/ELISA）、直(zhi)接(jie)熒光染色（ DiO 染料）  、電化(hua)學(xue) 性(xing)質變(bian)化和光學方法(fa)進(jin)行(xing)檢測。對(dui)於(yu)結(jie)果(guo)評估，還(hai)需(xu)要(yao)額外(wai)的(de)設(she)備，例如讀(du)板器(qi)或(huo)熒光顯微鏡(jing)等(deng).

蘇(su)州(zhou)阿(e)爾法(fa)生(sheng)物14年專註於(yu)生物實(shi)驗(yan)室儀(yi)器(qi)和生(sheng)物試劑(ji) 、實(shi)驗(yan)室耗材(cai)的專業供應商(shang)。提供的粒(li)度(du)分(fen)析(xi)儀(yi)、熒光顯微鏡(jing)等(deng)廣泛應用於細(xi)胞(bao)外(wai)泌(mi)體(ti)的研究。另(ling)外(wai)，提供的質粒(li)提取試劑(ji)盒(he)、PCR 試劑(ji)、壹(yi)抗、雙(shuang)抗、二(er)抗、抗(kang)體蛋白(bai)、單(dan)克隆抗體、基因組(zu)提取試劑(ji)盒(he)、RNA提取試劑(ji)盒(he)、Qpcr試劑(ji)、培(pei)養基、胎牛(niu)血清(qing)等(deng)生(sheng)物試劑(ji)也廣泛應用於生(sheng)命科(ke)學(xue)實(shi)驗(yan)。