人(ren)原代細(xi)胞的解凍方(fang)法(fa)

人(ren)原代細(xi)胞的解凍方(fang)法(fa)

 人(ren)原代細(xi)胞是(shi)直(zhi)接(jie)從(cong)組(zu)織(zhi)中分(fen)離(li)出(chu)來(lai)的(de)細(xi)胞，包括外(wai)周血、臍(qi)帶血(xue)和(he)骨(gu)髓。這(zhe)些細(xi)胞因(yin)其在生物(wu)過程(cheng)、疾(ji)病進展(zhan)和(he)藥物(wu)開(kai)發(fa)研究(jiu)以及包括基(ji)於(yu)體(ti)外(wai)細(xi)胞的分(fen)析或(huo)創建異(yi)種(zhong)移植(zhi)或人(ren)源化小(xiao)鼠(shu)模(mo)型在內(nei)的(de)應(ying)用中的(de)重(zhong)要性(xing)而(er)日(ri)益受(shou)到認(ren)可。
如(ru)果(guo)不(bu)需(xu)要(yao)立(li)即使(shi)用，新鮮的(de)原(yuan)代(dai)細胞通常會低溫保(bao)存（即冷(leng)凍），以(yi)便(bian)在液氮(dan)中長(chang)期(qi)儲存。處(chu)理新鮮樣品資源(yuan)有(you)限(xian)的(de)研究人(ren)員(yuan)也可以(yi) 購(gou)買(mai)冷(leng)凍的(de)即用型原(yuan)代(dai)細胞，包括單(dan)核細(xi)胞 (MNC)、純(chun)化的免疫細(xi)胞或造(zao)血(xue)幹(gan)細(xi)胞。解凍冷(leng)凍細(xi)胞時(shi)，正確的(de)技術和(he)處(chu)理可確(que)保(bao)細(xi)胞在下(xia)遊(you)應(ying)用中的(de)活力(li)、恢(hui)復(fu)和(he)功(gong)能(neng)。如何(he)解凍冷(leng)凍的(de)原(yuan)代細(xi)胞?
壹、實(shi)驗(yan)前準(zhun)備：
1. 添加(jia)了 10% 胎牛血(xue)清 (FBS)的(de) 改(gai)良培養(yang)基(ji)（IMDM）
2. DMEM 含(han) 4500 mg/L D-葡(pu)萄(tao)糖(tang)，添加(jia)了 10% FBS
3. RPMI 1640 培養(yang)基(ji)，添(tian)加(jia)了 10% FBS
4. 含 2% FBS 的磷酸(suan)鹽(yan)緩沖(chong)鹽(yan)水(shui)（例(li)如含(han) 2% 胎(tai)牛血(xue)清的(de)磷酸(suan)鹽(yan)緩沖(chong)鹽(yan)）
5. 2 mL 血(xue)清移(yi)液管（例(li)如nest 血(xue)清移(yi)液器，2 mL）
6. 25 mL 血清移(yi)液管（例(li)如nest 血(xue)清移(yi)液管，25 mL）
7. 50 mL 錐形(xing)管（例(li)如 nest離(li)心(xin)管，50 mL）
8. DNase I 溶液 (1 mg/mL)（天(tian)根(gen)試劑(ji)）
9. 細胞計數(shu)儀(yi)（博(bo)大博(bo)聚(ju)）
10. 臺盼(pan)藍（索(suo)萊(lai)寶）
11. 移(yi)液器（瑞(rui)寧移液槍(qiang)，rainin電動助(zhu)吸(xi)器）
12. 移液器吸(xi)頭(tou)（瑞(rui)寧，耐思(si)）
13. 人(ren)原代細(xi)胞
註意事(shi)項：
 在 37°C 水(shui)浴(yu)鍋(guo)中加(jia)熱(re)培(pei)養(yang)基(ji)。如(ru)果(guo)解凍細(xi)胞用於(yu)下(xia)遊(you)細(xi)胞分離(li)，可以(yi)使(shi)用含(han)有(you) 2% FBS 的 PBS。
 從(cong)儲存中取(qu)出(chu)冷(leng)凍細(xi)胞時(shi)，重要的(de)是(shi)盡量(liang)減少(shao)暴露於室(shi)溫(wen) (15 - 25°C)。如果(guo)不(bu)直接(jie)進(jin)行(xing)解凍，請(qing)將細(xi)胞置於(yu)幹(gan)冰或(huo)液氮(dan)容(rong)器中。
二(er)、解凍細(xi)胞
註意：建議(yi)壹次(ci)只(zhi)解凍壹(yi)個(ge)冷凍細(xi)胞小(xiao)瓶，以防止在較(jiao)高(gao)溫度下(xia)長(chang)時(shi)間(jian)暴露於 DMSO。
2.可 用 70% 乙(yi)醇或異丙醇擦拭(shi)細胞瓶的(de)外(wai)部(bu)。
 3.在生物(wu)安(an)全櫃中，將蓋子擰(ning)四分(fen)之壹圈以釋(shi)放內(nei)部壓力(li)，然後重新擰緊(jin)。
 輕輕旋轉小(xiao)瓶，在 37°C 水(shui)浴(yu)中快(kuai)速(su)解凍細(xi)胞。當仍有(you)少(shao)量(liang)冰時(shi)，取(qu)出(chu)小(xiao)瓶。這(zhe)大約(yue)需(xu)要(yao) 1 - 2 分(fen)鐘(zhong)。
三、細(xi)胞洗(xi)滌和(he)計(ji)數(shu)
註(zhu)意：重要的是(shi)在以(yi)下(xia)步(bu)驟中快(kuai)速(su)工作(zuo)以確(que)保高細胞活力(li)和(he)恢(hui)復。
 用 70% 乙(yi)醇或異丙醇再次(ci)擦拭(shi)小(xiao)瓶的外(wai)部(bu)。
 在生物(wu)安(an)全櫃中，使(shi)用 2 mL 血(xue)清移(yi)液器測量細(xi)胞懸浮液的總體(ti)積。該(gai)值在步(bu)驟 13 中用於(yu)計(ji)算提供的單(dan)元格(ge)總數(shu)。將細(xi)胞放回小(xiao)瓶中以(yi)混合(he)懸(xuan)浮液。
 取(qu)出(chu) 20 μL 等(deng)分的(de)細(xi)胞進行(xing)計(ji)數(shu)。如(ru)果(guo)使用臺(tai)盼(pan)藍評(ping)估活力(li)，對(dui)於(yu) ≥ 1 x 10 6 個(ge)細(xi)胞，至少(shao)添(tian)加(jia) 20 µL 培養(yang)基(ji)並(bing)記(ji)錄添加(jia)的培養(yang)基(ji)體(ti)積(ji)。對(dui)於 < 1 x 10 6 個細胞，直接(jie)用 20 µL 臺(tai)盼(pan)藍稀(xi)釋(shi)。將稀(xi)釋(shi)的等(deng)分試樣放在壹(yi)邊，直到第(di) 13 步。
重要(yao)提(ti)示(shi)：必須(xu)對(dui)解凍後(hou)（洗(xi)滌前）立即收(shou)集的等分試樣進行(xing)活細(xi)胞計數(shu)。這(zhe)將確(que)認(ren)提供的細(xi)胞數(shu)量(liang)，並(bing)跟(gen)蹤洗(xi)滌過程(cheng)中潛(qian)在的(de)細(xi)胞損失(shi)。在洗(xi)滌步驟中，預(yu)計(ji)細胞損失(shi)高(gao)達(da) 30%。

•  使用移(yi)液器將剩余(yu)的(de)細胞懸浮液轉移(yi)到 50 mL 錐形(xing)管中。

•  用 1 mL 培(pei)養(yang)基(ji)沖(chong)洗(xi)小(xiao)瓶並(bing)將其逐(zhu)滴添加(jia)到細(xi)胞中，同(tong)時(shi)輕輕旋轉 50 mL 管。

•  通(tong)過逐(zhu)滴添加(jia) 15-20 mL 的介質進(jin)行(xing)清洗(xi)，同(tong)時(shi)輕輕旋轉管子。

• 在室(shi)溫(wen) (15 - 25°C) 下(xia) 以(yi) 300 x g 離心細胞懸液10 分鐘(zhong)。

•  如果(guo)使用臺(tai)盼(pan)藍，對(dui)第(di) 8 步稀(xi)釋的(de)等(deng)分試樣進行(xing)細(xi)胞計數(shu)。

•  用移(yi)液器小(xiao)心地去除上(shang)清液，留下(xia)少(shao)量(liang)培(pei)養(yang)基(ji)以(yi)確(que)保(bao)細胞沈澱(dian)不(bu)受(shou)幹擾。輕(qing)輕彈動(dong)試(shi)管重(zhong)懸(xuan)細(xi)胞沈澱(dian)。

•  如(ru)果(guo)細(xi)胞開始(shi)結(jie)塊，每(mei)毫升(sheng)細胞懸浮液加(jia)入(ru) 100 µg DNase I 溶液，並(bing)在室(shi)溫(wen)下(xia)孵育(yu) 15 分(fen)鐘(zhong)。

註意：如果細胞將用於(yu) DNA 或(huo) RNA 提取(qu)，請勿(wu)添加(jia) DNase I 溶液。

•  輕輕地將 15-20 mL 的(de)介(jie)質添(tian)加(jia)到管中。

• 在室(shi)溫(wen)下(xia) 以(yi) 300 x g 離心細胞懸液10 分鐘(zhong)。

•  用移(yi)液器小(xiao)心去除上(shang)清液，留下(xia)少(shao)量(liang)培(pei)養(yang)基(ji)以(yi)確(que)保(bao)細胞沈澱(dian)不(bu)受(shou)幹擾。輕(qing)輕彈動(dong)試(shi)管重(zhong)懸(xuan)細(xi)胞沈澱(dian)。

   解凍後(hou)的(de) 細胞即可用於(yu)下(xia)遊(you)應(ying)用。
     蘇(su)州(zhou)阿爾法生物(wu)14年(nian)專(zhuan)註(zhu)於(yu)生命(ming)科(ke)學(xue)領(ling)域(yu)實(shi)驗(yan)室(shi)設(she)備及實(shi)驗(yan)室(shi)耗(hao)材和(he)試(shi)劑供應，包括振(zhen)蕩培養(yang)箱(xiang)、生物(wu)反(fan)應器、發(fa)酵罐(guan)、移(yi)液器、PCR儀、光學(xue)顯(xian)微(wei)鏡(jing)等，集實(shi)驗(yan)室(shi)設(she)計(ji)規劃(hua)、實(shi)驗(yan)室(shi)儀(yi)器設(she)備、生物(wu)實(shi)驗(yan)器材供應、售(shou)後(hou)服務(wu)為壹(yi)體的(de)壹(yi)站(zhan)式(shi)供應。